紫丁香与羽叶丁香叶绿体DNA提取方法研究

张靖雯，姜在民，蔡 靖*

(1.西北农林科技大学 林学院，陕西 杨陵 712100；2.西北农林科技大学 生命科学学院，陕西 杨陵 712100)

叶绿体是植物进行光合作用的细胞器，具有自主遗传信息，是植物细胞遗传的重要单位。高等植物的叶绿体DNA(chloroplast DNA,cpDNA)，一般长120～160 kb，多数为双链共价闭合环状分子，极少数为线状[1]，叶绿体基因组结构由长单拷贝序列(long single copy sequence,LSC)，短单拷贝序列(short single copy sequence,SSC)和2个反向重复序列(inverted repeat sequence A/B,IRA/IRB)组成，IRA和IRB编码相同，方向相反，被LSC和SSC隔开。被子植物叶绿体基因组序列高度保守，且属于母系遗传，具有分子量小、结构简单，进化速率低、多拷贝[2]等多方面优点。目前已在遗传结构分析[3]、分子标记[4]、起源进化[5]、核质互作和叶绿体基因工程[6]等方面展开了广泛研究，且叶绿体转化技术在遗传改良、生物制剂的生产等方面显示出巨大潜力[7]，已成为植物转基因技术又一新的研究目标[8]，而获得高质量的cpDNA是展开后续基因分子水平研究的必要条件。

相对于较成熟的基因组DNA提取方法而言，cpDNA的提取存在很大障碍，主要是由于物种之间差异性较大，核DNA的污染等。目前，关于叶绿体基因组的提取方法有很多，但是提取效率依然较低，不同植物提取叶绿体基因组的难易程度也各不相同。目前国内外对丁香属植物叶绿体基因组的研究较少，而提取出高质量的cpDNA是很多相关研究的关键所在。因此，本研究以现有的cpDNA提取方法为基础，建立适用于丁香属植物的cpDNA的提取方法体系，这对丁香属植物叶绿体基因组的进一步研究有重大意义。

丁香属(Syringa)植物为木犀科(Oleaceae)多年生灌木或小乔木，是本科著名的观花植物[9]，由于生境多样、适应性广、观赏性状独特而深受世界人民的喜爱,现已有近千年的栽培历史[10]。本试验所选取的植物材料紫丁香(Syringaoblata)和羽叶丁香(Syringapinnatifolia)分别为丁香属的广布种和濒危物种。紫丁香作为中国三北地区的广布种，广泛地应用于园林绿化当中，具有较高的观赏价值。羽叶丁香是我国三级濒危保护种，且具有较高的药用及观赏价值，是丁香属中唯一具有羽状复叶性状的物种，对于研究丁香属的亲缘关系、系统发育、地理分布等，都具有重要的科学意义。研究丁香属植物cpDNA的提取方法，并利用现代分子生物学技术，探究丁香属植物间的遗传多样性、亲缘关系和起源进化，对今后科学利用丁香种质资源有重要指导意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料及预处理

试验材料为紫丁香与羽叶丁香的成熟叶片，紫丁香叶片采自西北农林科技大学南校区丁香园，羽叶丁香叶片采自西北农林科技大学羽叶丁香种质资源圃。于2017年5月分别摘取2种植物新鲜叶片30～40 g，清水洗3遍，擦干，纱布包裹，置于4℃冰箱饥饿处理12～24 h。

1.2 方法

1.2.1 高盐-低pH法 参考C.Shi[11]等的方法。

1.2.2 改良的高盐-低pH法 参考K.Diekmann[12]、刘娟[13]、陈春梅[14]等的方法，并进行改进。

1.2.2.1 叶绿体分离 所有试验步骤均在冰上进行，玻璃器皿、离心管等提前预冷处理。

1) 匀浆：将叶片剪成1 cm长短，放入匀浆机(用小型榨汁机代替)，倒入400 mL预冷的缓冲液A(20 mmol/L EDTA-Na2，50 mmol/L Tris，1.25 mol/L NaCl，0.25 mol/L 抗坏血酸，1 mmol/L DTT，0.1%BSA，pH=3.6；抗坏血酸，BSA，DTT现用现加)，低速匀浆10 s，2次，高速匀浆10 s，3次。

2) 过滤：将匀浆液用4层无菌纱布过滤。

3) 去除细胞残骸：过滤后用50 mL离心管分装滤液，1 000 r/min，4℃，离心5 min，弃沉淀，重复1次。

4) 粗提：将上清4 000 r/min，4℃，离心10 min，弃上清。

5) 纯化：沉淀中加入25 mL预冷的缓冲液B(20 mmol/L EDTA-Na2，50 mmol/L Tris，1.25 mol/L NaCl，1 mmol/L DTT，0.1%BSA；BSA，DTT现用现加)，用无菌软毛刷悬浮沉淀，4 000 r/min，4℃，离心10 min，弃上清，重复1次。

6) 再纯化：沉淀加入5 mL预冷的缓冲液C(40 mmol/L蔗糖，50 mmol/L Tris，0.1%BSA；BSA现用现加)，用无菌软毛刷悬浮沉淀，4 000 r/min，4℃，离心10 min，弃上清。所得沉淀为纯化的叶绿体，用显微镜镜检叶绿体的完整性。

1.2.2.2 叶绿体裂解，cpDNA的分离纯化

1) 裂解：纯化叶绿体加入2 mL缓冲液D(50 mmol/L EDTA-Na2，100 mmol/L Tris，100 mmol/L NaCl，1 mmol/L DTT；DTT现用现加)，0.5 mL 20% SDS,10 μL蛋白酶K，55℃水浴3 h，使叶绿体裂解，释放出cpDNA。裂解结束后加入0.5 mL 5 mol/L KAc，冰浴20 min。

2) 抽提：加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，轻柔颠倒混匀，12 000 r/min，4℃，离心10 min，离心后，小心吸取上清液，重复1次。

3) 再抽提：加入等体积氯仿，轻柔颠倒混匀，12 000 r/min，4℃，离心10 min，小心吸取上清液。

4) 沉淀DNA：上清液加入等体积的异丙醇，-20℃，沉淀3 h，12 000 r/min，4℃，离心15 min，收集沉淀，70%乙醇清洗2次，无水乙醇清洗1次，自然挥发乙醇。

5) 除RNA除蛋白：沉淀加入0.5 mL 1×TE缓冲液，加入2.5 μL RNase(10 mg/mL)，37℃水浴1 h，再加入2.5 μL蛋白酶K(10 mg/mL)，37℃水浴1 h。

6) 沉淀DNA：加入1/10体积NaAc(3 mol/L)和两倍体积的无水乙醇沉淀过夜，12 000 r/min，4℃，离心15 min，收集沉淀，70%乙醇清洗2次，无水乙醇清洗1次，自然挥发乙醇。

7) 溶解DNA：加入50 μL 1×TE缓冲液溶解DNA，得到cpDNA溶液，-20℃保存，长期保存需放入-80℃超低温冰箱。

1.3 叶绿体镜检

取2 mL缓冲液D悬浮叶绿体沉淀，制作临时装片，在Leica DM4000B荧光显微镜下观察叶绿体的完整性。

1.4 cpDNA检测

1.4.1 cpDNA质量检测 取1 μL cpDNA溶液，在Nano Drop 2000C超微量分光光度计上测量核酸含量，用1×TE作空白对照，记录OD260nm/OD280nm值、OD260nm/OD230nm值及质量浓度。质量高的DNA的OD260nm/OD280nm值在1.8～1.9，>1.9表明样品存在RNA污染，<1.7表明样品存在蛋白质、酚类污染；纯DNA的OD260nm/OD230nm值为2.5，<2.0表明样品存在糖类、盐类或有机溶剂污染，需纯化。

1.4.2 琼脂糖凝胶电泳检测 取4 μL cpDNA溶液，加0.8 μL DNA loading buffer混匀，使用bio-rad Power pac Universal电泳仪，在0.5%琼脂糖凝胶中电泳，上样量为4 μL，电泳缓冲液为1×TAE，电压为120 V，电泳30 min，在紫外凝胶成像系统下检测蛋白是否除干净、RNA是否除彻底、cpDNA的完整性。

2 结果与分析

2.1 丁香叶绿体完整性检测

采用高盐-低pH法(方法Ⅰ)和改良高盐-低pH法(方法Ⅱ)，分别得到了紫丁香(Z)和羽叶丁香(Y)的叶绿体。对比图1可发现，方法Ⅱ所得的叶绿体沉淀更多；对比图2镜检结果可发现，方法Ⅱ分离的叶绿体浓度高、数量多、杂质少、背景清晰，说明改良高盐-低pH法更适合丁香叶绿体的分离。

注：Ⅰ、Ⅱ分别代表高盐-低pH法和改良高盐-低pH法，Z、Y分别代表紫丁香和羽叶丁香。下同。

2.2 丁香cpDNA质量检测

由表1的紫外分析结果可知，2种提取方法所得的cpDNA的各项质量指标差异显著，方法Ⅰ所提取的紫丁香与羽叶丁香的cpDNA质量浓度仅为64.1 ng/μL和171.6 ng/μL，OD260/OD280值分别为1.32和1.29，均<1.7，表明样品存在蛋白、酚的污染，OD260/OD230值分别为1.34和1.00，均<2.0，表明样品存在被糖类、盐类或有机溶剂污染，不能满足后续的测序要求以及叶绿体基因组的深入研究。方法Ⅱ所提取的紫丁香与羽叶丁香的cpDNA质量浓度分别为650.1 ng/μL和330.3 ng/μL，OD260/OD280值分别为1.86和1.88，在纯净的DNA比值1.8～1.9，OD260/OD230值分别为2.35和2.58，大于衡量DNA纯净比值2.0，表明方法Ⅱ所提取的DNA质量好，浓度和纯度高，不存在蛋白、酚类、盐以及有机溶剂等的污染。上述结果表明改良的高盐-低pH法适合丁香叶绿体cpDNA的提取，能够满足后续的测序要求以及叶绿体基因组的深入研究。

2.3 丁香cpDNA电泳检测

由图3的琼脂糖凝胶电泳结果可知，方法Ⅰ所提取的cpDNA无明显条带，而方法Ⅱ所提取的cpDNA条带清晰，明亮，整齐一致，无降解现象，无RNA、蛋白、盐等杂质的污染，所得cpDNA纯度较高，质量好。

图2 高盐-低pH法(Ⅰ)和改良高盐-低pH法(Ⅱ)分离的叶绿体镜检比较Fig.2 Comparison of chloroplast microscopy seperated by the high-salt low-pH method (Ⅰ) and the modified high-salt low-pH method (Ⅱ)

表1 2种方法提取的cpDNA紫外分析结果Table 1 UV scanning results of cpDNA extracted by two methods

注：M代表5 000 DNA Ladder Marker。

3 结论与讨论

获得高质量、高纯度的cpDNA样品，是后续基因分子水平研究的前提条件。cpDNA提取的关键是去除叶绿体膜外的核DNA与线粒体DNA污染。高盐-低pH法分离叶绿体的原理是通过叶片在高速匀浆过程中，产生大量静电,核DNA被组蛋白包裹带正电,紧紧地被吸附在带负电的叶绿体膜上，而在高盐介质环境中由于电子屏蔽作用，这种静电作用被减弱,因此可以通过不同pH值的高盐缓冲液反复洗涤，以达到去除吸附的核DNA的目的[15]，而由于线粒体与叶绿体差别较大,通过差速离心就可分离。其他关于cpDNA的提取方法主要有DNaseⅠ法[16]、蔗糖密度梯度离心法[17]、percoll密度梯度离心法[18]、氯化铯密度梯度离心法[19]等。DNaseⅠ法利用DNaseⅠ消化膜外的DNA，以达到消除核DNA以及线粒体DNA污染的目的，但经过匀浆和多次离心后，叶绿体膜难以保持完整，使得膜内的cpDNA也被消化掉，cpDNA得率低[15]；蔗糖密度梯度离心法无法将完整的叶绿体与破碎的叶绿体分离，密度梯度液不易保持，对离心机等设备要求高，分离效果不理想；氯化铯密度梯度离心法主要用于草本植物cpDNA的提取，且其成本高、耗时长、得率低、对设备要求也较高，一般实验室难以采用[20]；percoll密度梯度离心法虽可较简便地分离提取cpDNA，但所提取的cpDNA得率较低，且percoll分离液的价格偏高。因此，这几种方法均无法简便高效地提取植物cpDNA。

本研究采用了高盐-低pH法[11]和改良的高盐-低pH法[12-14]，分别提取了紫丁香与羽叶丁香的cpDNA。C.Shi[11]的高盐-低pH法已成功提取了葡萄[21]、无患子[22]、三叶青[22]、枣[23]等植物的cpDNA,但此方法并不适合丁香cpDNA的提取，经紫外分光光度计检测，所提取的紫丁香与羽叶丁香cpDNA的OD260/OD280<1.7，OD260/OD230<2.0，且质量浓度较低，表明提取的cpDNA纯度低，含有蛋白、酚类、盐以及有机溶剂等的污染，琼脂糖凝胶电泳也发现并无条带，表明所提取的cpDNA含量小，浓度低，结果证明C.Shi[11]的高盐-低pH法并不适合丁香cpDNA的提取，分析可能是C.Shi[11]的高盐-低pH法在叶绿体分离过程中，离心时间过长，是本研究改进的高盐-低pH法分离叶绿体离心时间的两倍，因此导致叶绿体活性大幅降低；叶绿体裂解时间过长，导致基因组DNA片段断裂，使得最终提取结果cpDNA的质量、浓度都达不到要求。之后采取K.Diekmann[12]、刘娟[13]、陈春梅[14]等的方法进行组合，并根据丁香的特性加以改进，形成改良的高盐-低pH法，所提取的紫丁香与羽叶丁香的cpDNA的OD260/OD280值在1.8～1.9，OD260/OD230值接近2.5，且质量浓度分别高达650.1 ng/μL和330.3 ng/μL，表明提取的cpDNA质量好、纯度高，琼脂糖凝胶电泳显示条带清晰、明亮，无降解现象，结果证明改良后的高盐-低pH法适合紫丁香与羽叶丁香cpDNA的提取。本研究在高盐-低pH法的基础上，做了如下改进：提取前，将新鲜叶片放入4℃冰箱，将饥饿处理时间减少到12～24 h，去除叶片中的淀粉等糖类物质，减少糖类物质对后续提取工作的影响；由于叶绿体离体后活力会迅速下降，所以叶绿体分离过程要快，本试验开始采用研钵进行手工研磨，发现手工研磨会使叶片研磨不彻底，费时费力且导致叶绿体活性下降严重，因此采用匀浆机代替手工研磨匀浆，减少匀浆时间，避免叶绿体离体时间过长导致的活力下降，并采用短时多次的匀浆方法，避免匀浆机发热，破坏叶绿体被膜；用DTT(二硫苏糖醇)代替β-巯基乙醇作为还原剂，DTT具有比β-巯基乙醇更低的毒性和更小刺激性的气味，且其抗氧化性是β-巯基乙醇的7倍，能更有效组织酚类物质的氧化，并进一步提高叶绿体完整性；增加了氯仿抽提，是因为酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)抽提后，会有酚污染残留，由于酚易溶于氯仿中，因此增加氯仿抽提，以达到进一步排除酚污染的目的；试验最后再次加入少量蛋白酶K，37℃水浴1 h，以达到进一步去除蛋白残留的目的；在使用RNase和蛋白酶K处理了cpDNA溶液后，再次进行酒精沉淀洗涤cpDNA，是为了减少所得cpDNA溶液中的其他杂质，提高所得cpDNA质量。

本研究改良的高盐-低pH法可较快速简单地提取丁香cpDNA，所提取的cpDNA可用于叶绿体基因组分子水平的后续研究。此提取方法对实验室仪器设备要求不高，操作简便、成本低，可为木本植物cpDNA的提取提供参考。