上海地区2011—2014年手足口病病原谱变化和流行规律分析

张晓玲　俞慧菊　宋志刚　王蔚

摘要：【目的】了解2011—2014年间上海地区手足口病病原谱的构成变化，掌握手足口病主要致病原的流行规律，为做好上海地区手足口病的防控工作提供参考。

【方法】采集2011年1月至2014年12月期间两家哨点医院临床诊断为手足口病患儿的咽拭子、粪便、疱疹液和脑脊液，进行肠道病毒通用和分型PCR检测。绘制上海地区2011至2014年的手足口病病原谱，分析手足口病主要致病原阳性检出的分布规律。

【结果】共采集上海地区2.764例手足口病患儿的4.088份标本。肠道病毒通用检测阳性率为76.88%，主要致病原为肠道病毒71型（EV71）、柯萨奇病毒A组16型（CA16）、柯萨奇病毒A组6型（CA6）和柯萨奇病毒A组10型（CA10），其阳性检出率分别为35.78%，16.53%，17.55%和2.28%。2011年上海地区手足口病主要以EV71和CA16流行为主；2012年EV71的构成比下降，CA6的构成比上升；2012年10月至2013年9月期间CA6出现高位流行，2013和2014年主要以EV71和CA6流行为主。2014—2015年上海地区流行的CA6属于D7亚型。

【结论】上海地区手足口病病原谱的构成逐年发生变化，不同型别的肠道病毒呈现交替流行，其中CA6的构成比增加较快，已成为上海地区手足口病的主要致病原。对引起手足口病的肠道病毒进行持续分型监测，对上海地区手足口病的防控工作具有重要意义。

关键词：手足口病；肠道病毒71型；柯萨奇病毒A组6型

中图分类号：R373.2 文献标志码：A

近年来，手足口病（hand，foot and mouth disease，HFMD）的暴发流行已引起全球的广泛关注。中国疾病预防控制中心法定传染病系统数据显示，2014年1月至12月，全国共报告2.778.861例手足口病例，其中501例死亡（http：//www.nhfpc.gov.cn/zhuzhan/yqxx/lists.shtml）。持续监测手足口病病原体，了解手足口病病原谱的构成变化并掌握手足口病主要致病原的流行规律，对做好手足口病防控工作具有重要意义。为此，2011年至2014年间，本课题组采集了临床诊断为手足口病患儿的临床标本进行肠道病毒通用和分型核酸检测，并进一步绘制了各年手足口病病原谱，分析了手足口病主要致病原的分布特征。

1 对象与方法

1.1 研究对象

2011年1月至2014年12月，共采集两家哨点医院（上海市公共卫生临床中心、上海交通大学附属新华医院）临床诊断为手足口病的2.764名患者的4.088份标本，诊断依据为原卫生部颁布的《手足口病诊疗指南（2010版）》。对采样病例的纳入标准如下：① 发热≥37.5℃，持续一天以上；② 伴有全身或局部的皮肤或黏膜出疹。对于重症病例的纳入标准除符合采样病例纳入标准外，还伴有肌痉挛、脑炎、心肌炎、心肺衰竭及肺水肿等一项或多项症状。

采集标本放入病毒采样管（友康基业生物科技有限公司，货号01130803），暂存于4℃，48 h内冷链运送至上海市公共卫生临床中心实验室。

1.2 材料与方法

1.2.1 核酸抽提 以罗氏公司的核酸抽提试剂盒（High Pure Viral Nucleic Acid Kit）试剂盒抽提标本中的病毒核酸（DNA/RNA），操作步骤按试剂盒的说明进行，抽提物用50 μL洗脱液溶解，立即置-70℃冰箱保存备用。

1.2.2 肠道病毒通用和分型检测 所有标本抽提核酸后，进行肠道病毒通用检测。肠道病毒通用阳性的标本继续用EV71、CA16、CA6和CA10的特异性引物和探针进行分型[1]。

1.2.3 snPCR扩增后测序分型 由EV71、CA16、CA6和CA10的特异性引物和探针检测后未能分型的肠道病毒通用阳性标本，再参照Nix等[2]设计的snPCR方法进行扩增，所获的阳性产物送某生物科技有限公司进行双向测序，最后通过NCBI网站的BLAST（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行序列比对而确定型别。

1.2.4 CA6的系统进化树分析 随机选取2011—2014年各月上海地区的CA6代表株进行VP1基因全长序列扩增，扩增引物和方法同前期发表文章[3]。同时选取GenBank中世界范围不同年代的CA6参考序列，用ClustalX 2.0比对序列后，以MEGA 5.0软件中的邻近法和Kimura2-parameter模型，基于VP1全长915个核苷酸构建系统进化树，自举检验重复1.000次。

2 结果

2.1 标本收集

2011年1月至2014年12月，共采集两家哨点医院（上海市公共卫生临床中心、上海交通大学附属新华医院）临床诊断为手足口病的2.764例患儿的临床标本，对于重症病例标本，在出院前再重复采集一次。所采集的标本类型包括咽拭、粪便、疱液和脑脊液，各年采集的标本数见表1。

2.2 2011—2014年手足口病病原谱

对2 764例手足病患儿的标本进行肠道病毒通用和分型检测。结果显示：2011年1月至2014年12月，肠道病毒通用检测阳性率为76.88%（2 125/2.764）。檢出率最高的肠道病毒型别为EV71、CA16、CA6和CA10，其阳性率分别为35.78%（989/2.764）、16.53%（457/2.764）、17.55%（485/2.764）和2.28%（63/2.764）；除这4种主要型别的肠道病毒外，通过snPCR扩增后测序的方法检出的其他肠道病毒型别有柯萨奇病毒A组的2、4、5、8、9、12、14型（CA2、CA4、CA5、CA8、CA9、CA12、CA14），柯萨奇病毒B组的1型（CB1）及埃可病毒的6、9型（Echo6、Echo9），占2.21%（61/2.764）；未分型的肠道病毒占2.42%（67/2.764）；阴性占23.12%（639/2.764）；另外还检出3例混合感染病例：EV71和CA16混合感染2例，CA6和CA16混合感染1例（图1）。

2.3 2011—2014年手足口病病原谱的构成

由表2可见，EV71、CA16、CA6和CA10是上海地区近年来流行的手足口病主要致病原，但其构成比逐年发生变化。2011年，上海地区手足口病的主要致病原为EV71，占46.33%（682/1.472），其次为CA16，占19.57%（288/1.472），CA6和CA10所占比例较少，分别为7.61%（112/1.472）和3.13%（46/1.472）；2012年，EV71和CA16的构成比有所下降，为25.1%（123/490）和15.51%（76/490），而CA6所占比例上升很快，为17.55%（86/490），CA10为1.63%（8/490）；至2013年，CA6已上升为手足口病主要致病原的首位，构成比为53.25%（195/366），EV71仅为16.67%（61/366），CA16和CA10均为2.46%（9/366）。2014年，EV71又回升至首位，构成比为28.21%（123/436），CA6和CA16分别为21.10%（92/436）和19.27%（84/436），CA10未检出。

2.4 手足口病主要致病原检出的时间分布

对上海地区手足口病主要致病原EV71、CA16、CA6和CA10進行月份检出的分析（图2），结果显示EV71和CA16的流行高峰常年稳定在5～7月，EV71在5～7月的检出率占其全年阳性检出的39.88%（2012年）～56.91%（2014年），CA16为28.82%（2011年）～36.84%（2012年），其余月份EV71和CA16的阳性检出相对较少；而CA6在全年各月均有不规律的阳性检出，无明显流行高峰；CA10在2011年的各月均有检出，但2012至2014年期间仅有个别阳性检出，也无明显流行高峰。值得注意的是，CA6在2012年10月起检出阳性率大幅上升，高位流行的情况一直持续至2013年9月，在此期间的各个月份，CA6的阳性检出率远远超出了其他型别的肠道病毒。到2014年，EV71在4—7月有较高阳性检出率，而随后的8—12月，CA6的阳性检出率又超出了EV71，手足口病的主要致病原呈现出了交替流行的趋势。

2.5 2011—2014年CA6流行株的系统进化树

基于136个CA6的VP1全长序列，包括2011—2014年上海地区的CA6流行株（2011年21株、2012年12株、2013年13株、2014年16株）和国际上74个CA6代表株构建的VP1全长系统进化树见图3。根据国际上EV71的分型方法：VP1的核苷酸同源性差异在15%～20%间，为不同基因型；在4%～14%间，为不同基因亚型，我们将国际上个流行的CA6序列分为4个型：A～D，其中D型又分为7个亚型：D1～D7（核苷酸同源性为88.6%～100%）。

3 讨论

中国手足口病持续流行，每年感染病例数可达百万， 死亡病例超数百，其报告发病率和死亡率在丙类传染病中居首位，是我国公共卫生工作面临的巨大挑战， 对居民造成很大的经济负担。 因此，了解上海地区手足口病病原的流行规律，对预防和控制手足口病均具有重要意义。本研究采集了2011年1月至2014年12月上海地区来自两家哨点医院的2 764例手足口病患儿的4 088份临床标本，对每份标本用肠道病毒通用核酸检测初筛后，阳性标本进行EV71、CA16、CA6和CA10的核酸检测，并进一步用snPCR扩增测序的方法对未知型别的肠道病毒进行分型。其中复旦大学附属新华医院是本实验室采集样本的主要哨点医院，上海市公共卫生临床中心的采样数量很少，由于课题研究纳入哨点医院数量有限，没有覆盖整个上海地区。本研究获得的上海地区手足口病病原谱可能与上海地区手足口病流行的实际总体情况可能存在一定差异。

分析2011—2014年各年手足口病病原谱的构成，结果显示上海地区手足口病的主要致病原已由原来的EV71和CA16变为EV71和CA6，这与中国国内广州、江苏等地近年来的研究结果一致[4-6]。此外，根据手足口主要致病原的月份分布图：2011年全年各月都有CA6的散发病例，2012年秋季至2013年全年上海地区CA6保持高位流行，2014年CA6在秋冬季又有较高检出率。以往国际上报道CA6在秋冬季流行[7-8]，与EV71流行高峰为夏季不同，推测可能与病毒自身对温度的敏感性相关。

国内外对CA6的基因型和基因亚型尚缺乏统一标准。因此，本研究对CA6的分型借鉴国际上EV71的分型标准[9] ，即基于结构蛋白VP1的核苷酸序列，差异在15%～20%为基因型，差异在4%～14%为基因亚型。根据这一分型标准，我们将上海地区流行的CA6定为D7亚型，与Bian等[10]将国际上流行的CA6分为A～E型的分型方法不一致。

过去的观点认为，CA6通常只引起疱疹性咽峡炎，致病能力有限[11]，然而随着2008年芬兰CA6暴发的报道[12]，全球包括中国的多个省份都陆续报道了导致手足口病的CA6流行[12-24]，重症病例、成人感染报道也较多[24-26]，可见在手足口病致病原监测和研究中大家对CA6已逐步重视。 此外，肠道病毒在进化过程中频繁出现基因重组和突变，重组变异有利于优势变异株的传播流行， 从而引起疫情暴发，重组后的病毒毒力可能增强，引发重症。 因此，分析手足口病主要致病原的基因进化情况，有助于在临床上适时调整手足口病的防控和治疗策略，也有助于药物设计和疫苗研发。

由于目前我国研发上市的手足口病疫苗以EV71为主[27]，随着非EV71非CA16的其他型别肠道病毒的新现，已开发疫苗是否有交叉保护作用，是否还需研发其他型别肠道病毒的疫苗值得深入探讨。

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（收稿日期：2017-08-29 ）