一例罕见AB亚型的分子生物学研究分析*

李双玉，董 磊，解金辉，赵 瑛 (天津市血液中心，天津 300110)

ABO血型系统在临床输血中占有极其重要的地位，其血型鉴定是保障输血安全的必要前提。临床上，一般通过正反定型即可确定ABO血型，但是，有时会遇到正反定型不符或凝集强度弱于正常的情况，难以准确鉴定血型，这时就需要应用其他检测方法来帮助鉴定血型。下面是我们遇到的一例献血员标本，虽然正反定型一致，但是凝集强度发生变化，影响血型鉴定，详情如下。

1 材料与方法

1.1 对象 本中心检验科送检的一例献血员ABO疑难血型标本。

1.2 试剂与方法

1.2.1 试剂:单克隆抗 A，抗 B血清(批号20170408，上海血液生物医药有限公司)，反定型细胞(批号20175327，上海血液生物医药有限公司)，抗H血清(批号OHM117，德国CE-IMMUNODIAGNOSTIKA)，全血基因组DNA抽提试剂盒(批号151048736，QIAGEN)，ABO基因分型试剂盒(批号201609025，20170614，秀鹏生物技术有限公司)。ABO血型，H抗原鉴定按照相关试剂说明书和参考书［1］进行。

1.2.2 血清学检测:采用试管法做正反定型，同时设O细胞和自身细胞作对照。

1.2.3 基因分型:抽提该献血者全血基因组DNA，用聚合酶链式反应(polymerase chain reation PCR)进行基因分型。

1.2.4 直接测序:针对第6，7外显子设计引物，第6外显子正向引物CCCGGTTGGAGTCGCATTT，反向引物是ATGAGCTCAGTAAGATGCTGCA;第7外显子正向引物AAGCCTTCCAATGGCCGCT，反向引物TCACGGGTTCCGGACCGCCT，先对该标本进行PCR反应，然后将PCR产物和第6，7外显子引物送英潍捷基(上海)贸易有限公司直接测序。

2 结果

2.1 血清学结果 见表1。正定型是AB型，反定型也是AB型，但是凝集强度有变化，提示可能是亚型。

表1 该献血者正反定型试验结果

2.2 PCR分型结果 分别用秀鹏生物技术有限公司的两种试剂盒ABO-Ⅱ代和B亚型做基因分型，按照试剂说明书操作。对照其结果分型表(试剂盒每一孔所含引物已标注在电泳胶图上)判断ABO的基因型。ABO-Ⅱ代试剂盒的基因分型结果是A2/B，见图1，A侧是亚型，具体是A2中的哪一种亚型不能确定。B亚型试剂盒的基因分型结果是 A/Bw12，见图 2。

图1 ABO-Ⅱ基因分型结果

图2 B亚型基因分型结果

2.3 测序结果 第467碱基 C突变T，1009碱基A突变G，引起第156氨基酸由脯氨酸(P)变成了亮氨酸(L)，337位由精氨酸(R)变成甘氨酸(G)，符合A205的变化。B侧突变位置比B101多一个，即278碱基C突变T，导致93位的脯氨酸(P)变为亮氨酸(L)，与 Bw12一致。测序结果是 A205/Bw12。

3 讨论ABO血型系统是最早发现的血型系统，也是临床输血中最重要的血型系统之一。ABO血型基因位于染色体9q34，其编码区包含有7个外显子，第6和第7外显子就包含糖基转移酶77%的氨基酸序列［3］，因此这两个外显子在ABO血型基因定型方面非常重要。A基因和B基因分别编码N-乙酰氨基半乳糖转移酶和a-1，3-D-半乳糖基转移酶，这两种酶催化底物分子转移至H抗原上，形成了A抗原和B抗原。当基因的外显子中有碱基发生改变时，就会引起形成糖基转移酶的氨基酸发生变化，进而影响转移酶的性质和活性，导致细胞表面抗原质量或数量变化。ABO亚型是指红细胞表面A抗原或者B抗原存在的数量不同于正常A型或者B型，以至于在检测过程中表现为凝集强度弱于正常血型。

在血型亚型中，A亚型比B亚型更常见，而A2是最常见的一个亚型。A1和A2的抗原决定簇在数量上是有区别的，其中A1的抗原点位约为8×105～12×105，而 A2 的抗原点位约为 1×105～4×105，但是在用单克隆抗A血清检测A2时，这些抗原点位足以能够产生很强的凝集而无法与A1相区别。A1和A2的区别不仅仅是抗原决定簇数量上的差别，同样存在质的区别，现在应用最广泛的抗A1试剂是双花扁豆外源性凝集素，很容易将A1和A1B与A2和A2B细胞区分开。国外有文献报道高加索人中几乎所有A2亚型的遗传基因皆为A201［4］，而国内的研究与此不同，中国人群中的A2等位基因以 A205为主［5，6］。弱的 B 变异型相对较少，而且难以分类，目前较多报道的有B(A)，B3，Bel，Bw 等。

为保障输血安全，正确鉴定ABO血型，避免出现因ABO血型不合而导致严重的输血反应非常重要。临床上常用血清学方法鉴定ABO血型，这种方法易受实验室操作不当、不规范操作、生理因素、疾病、治疗措施等诸多因素影响，出现正反定型不符或凝集强度变化的情况［2］。对于患者而言，出现上述情况时不仅要考虑亚型的可能性，还要考虑年龄、疾病、药物等多种因素带来的影响。而对无偿献血者(健康人)来讲，相对简单些，亚型的可能性比较大。

本文中的献血者红细胞与单克隆抗A血清反应呈强凝集，而与抗A1血清反应呈弱凝集结果，故血清学倾向于A2型，而与抗B血清反应凝集强度明显低于正常凝集，又怀疑有B亚型，通过PCR和直接测序验证了这一结果。本文中献血者虽然是AB双侧亚型，但没有抗体，其与AB型患者盐水、凝聚胺和卡式交叉配血均阴性，其血液可以输注给交叉配血相合的AB型患者。如果献血员体内有抗体，为了输血安全，最好不要给患者输注这种血液。如果患者是这种血型，我们首选主侧配血阴性的洗涤O型红细胞，血浆、单采血小板选AB型;有条件再寻找交叉配血阴性的同型红细胞。有文献报道在紧急情况而又无库存洗涤红细胞时，也可以输注O型去白悬浮红细胞［7］。

在日常工作中，当出现正反定型不符时，很容易引起实验人员的注意，但是对出现正反定型一致，只是凝集强度发生变化，加之实验人员经验不足，容易被忽略、漏检，应该引起注意。目前，红细胞血型鉴定的方法很多，当通过抗人球试验、吸收放散、酶化实验等多种血清学方法无法鉴定血型时，可以利用分子生物学技术作为补充，帮助鉴定血型。