T-SPOT.TB，TB-Ab和TB-DNA在肺结核与非结核分枝杆菌肺病鉴别诊断中的价值研究*

邵吉宝，王相栋，夏 睿，邵 燕，徐春华，严 虹

(东南大学医学院附属南京市胸科医院a.检验科;b.呼吸内科，南京 210029)

肺结核(pulmonary tuberculosis，PTB)是由结核分枝杆菌复合群引起的慢性传染性疾病，其发病率和死亡率都在逐年增加。与此同时，非结核分枝杆菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)肺病发病率也不断增加，我国2010年全国结核病流行病学抽样调查显示结核培养阳性的标本中非结核分枝杆菌占到11.1%［1］。PTB与NTM肺病在临床特征、影像学表现、病原学检查和组织病理学改变等方面都非常相似，鉴别诊断相对困难，临床易误诊。目前临床常用对硝基苯甲酸(4-Nitrobenzoic acid，PNB)选择性培养基法鉴别PTB与NTM［2］，但培养方法耗时长且标本培养阳性率较低，在两者中鉴别诊断价值有限。因此，需要寻找快速准确易于推广的实验室检查方法，是目前亟待解决的问题。近年来大量研究表明，T淋巴细胞酶联免疫斑点试验(tuberculosis T lymphocytes enzyme-linked immune SPOT test，T-SPOT.TB)、结核抗体(mycobacterium tuberculosis antibody，TB-Ab)和结核杆菌脱氧核糖核酸(tuberculosis bacterium deoxyribose nucleic acid，TB-DNA)在结核病的鉴别诊断中具有重要价值。因此，本研究通过对两类患者进行 TSPOT.TB，TB-Ab(胶体金法和蛋白芯片法)和TBDNA检测，以评价它们在PTB和NTM肺病鉴别诊断中的价值。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2016年4～12月在南京市胸科医院住院治疗的肺结核患者140例，所有患者均通过肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)培养确诊为结核分枝杆菌感染。所有患者年龄为17～78岁，平均年龄38.4±16.6岁，其中男性78例，女性62例。同时，选取2013年3月～2017年4月在南京市胸科医院确诊为NTM肺病患者39例，所有患者BALF或痰培养确诊为非结核分枝杆菌感染。所有患者年龄36～81岁，平均年龄61.6±11.0岁，其中男性14例，女性25例。NTM肺病诊断符合中华医学会结核病学分会2000年对非结核分枝杆菌肺病诊断标准［3］。NTM组和PTB组相比，NTM组病人以中老年人居多，且女性更多见。

1.2 仪器与试剂 T-SPOT.TB试剂:英国Oxford Immunoter公司生产，上海复星科技有限公司提供。TB-Ab IgG/IgM(胶体金法)试剂:北京健乃喜生物技术有限公司。TB-Ab IgG(蛋白芯片法)试剂及PBT-X4生物芯片识别仪(南京大渊生物技术有限责任公司)。荧光定量PCR(realtime fluorescence quantitative PCR，RTFQ-PCR)仪器为罗氏公司Roche Light Cycler，试剂购自中山大学达安基因股份有限公司。

1.3 方法 四种方法的操作均严格按照说明书进行。

1.4 统计学分析 以临床诊断为金标准，计算四种方法的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、假阳性率、假阴性率、阴性似然比、阳性似然比、诊断符合率和约登指数。用SSPS 20.0软件进行两组间配对χ2检，P＜0.05为差异有统计学意义。当最小理论频数 T＜1或总频数n＜40，用Fisher’s Exact Test，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 四种方法的检测结果

2.1.1 阳性检出率:179例患者四种方法的阳性检出率分别为74.3%，44.7%，63.7%，63.1%。见表1。

表1 四种方法检测结果

2.1.2 四种方法的统计学指标:见表2。

表2 四种方法的方法学指标

2.2 四种方法的敏感度、特异度和诊断符合率统 计分析 T-SPOT.TB法敏感度显著高于TB-Ab(胶体金法)，TB-Ab(蛋白芯片法)和 TB-DNA(χ2=9.87～74.86，P＜0.01)。T-SPOT.TB 法特异度显著高于TB-Ab(胶体金法)，TB-Ab(蛋白芯片法)(χ2=13.18～24.98，P＜0.01)，而与 TB-DNA 比较差异无统计学意义(Fisher’s Exact Test，P=0.62＞0.05)。T-SPOT.TB诊断符合率显著高于TB-Ab(胶体金法)，TB-Ab(蛋白芯片法)和 TB-DNA，差异有统计学意义(χ2=6.91～87.46，P＜0.01)。

3 讨论肺结核是由结核分枝杆菌复合群引起的肺部感染性疾病，是造成死亡人数最多的单一性传染病。NTM肺病是由NTM复合群感染肺引起的肺组织病变，易引起中老年人，特别是老年女性［4，5］及原有慢性肺部基础疾病及免疫力低下人群发病。NTM肺病对常用的抗结核药均有耐药性且易引起院内感染，需引起重视。目前鉴别PTB与NTM肺病金标准是依靠实验室对培养的分枝杆菌菌种进行鉴定。常用的方法是在对硝基苯甲酸(PNB)培养基进行培养鉴别(结核分枝杆菌不能生长而NTM可以生长)。但该法前提是标本必须培养出分枝杆菌，而且培养周期很长，很难满足临床需求。其他的方法包括抗酸杆菌培养阳性的液体培养基中的MPB64抗原检测、HPLC检测细胞壁分枝杆菌菌酸、同源基因序列比较鉴定、分子生物学检测［6］等。但这些方法技术复杂、设备昂贵，不适合一般医院常规检测。而用细胞免疫及体液免疫相关方法来鉴别PTB与NTM肺病还不多见。

细胞介导免疫反应是抗结核分枝杆菌感染的重要机制。因此可以用ESAT-6，CFP-10刺激被结核杆菌抗原致敏的T细胞并使之活化，活化的T细胞(CD4+，部分 CD8+)会产生 γ-干扰素，通过 γ-干扰素检测来判断机体是否被结核分枝杆菌感染，这是T-SPOT.TB的检测原理。ESAT-6，CFP-10在所有卡介苗及绝大部分环境分枝杆菌中缺失，这就保证了T-SPOT.TB的高特异度［7］。同时，酶联免疫技术保证了T-SPOT.TB的高敏感度。本研究显示在PTB与NTM肺病的诊断中，T-SPOT.TB的敏感度、特异度、诊断符合率分别为92.9%，92.3%，92.7%，这与国内文献报道一致［8～10］。在本研究中，TB-DNA仅检测了培养阳性的BALF或痰标本，而有研究显示TB-DNA在所有肺结核患者BALF或痰中敏感度、特异度及诊断符合率为46.1%，98.4%和51.6%［11］。而 T-SPOT.TB在涂片阳性、涂片阴性肺结核患者中敏感度、特异度及诊断符合率无显著差异［12］。故对整体患者而言，TSPOT.TB有最好的敏感度、特异度和诊断符合率。在本研究中PTB组仍有少数患者T-SPOT.TB为阴性，可能有以下几种情况:①免疫系统功能不全的疾病如HIV患者，免疫抑制剂使用患者等;②标本获取时间在细胞免疫发生前;③前期进行抗结核治疗可使效应细胞消失;④实验非正常操作引起。在NTM肺病组出现假阳性，可见于:①NTM病原菌为堪萨斯分枝杆菌(M.kansa-ssi)、海分枝杆菌(M.marimum)、苏尔加分枝杆菌(M.szulgai)和戈登分枝杆菌(M.gordonae);②体内有残存的结核特异性效应T细胞，但其在体内存活期很短，一般在病原菌消灭后即消失。本研究中NTM肺病组中有一例T-SPOT.TB为阳性的患者，其2015年5月诊断为PTB并进行规范化治疗，2016年3月入院并诊断为NTM肺病。此患者T-SPOT.TB检测值较低，紧邻CUT-OFF值，其阳性结果可能是体内残留有致敏T细胞引起。

本研究表明，TB-Ab检测的敏感度、特异度及诊断符合率最低。阳性仅表示检测者感染过结核杆菌，不一定发病。我国城市居民结核感染率近六成，且普遍接种过卡介苗，易导致假阳性。而在感染早期或免疫低下患者可出现假阴性。同时，TBAb检测所用的抗原为结核分枝杆菌和NTM共有成分或有交叉的成分，因此该方法对两种疾病的鉴别诊断意义不大。

综上所述，T-SPOT.TB相较于TB-Ab(胶体金法)，TB-Ab(蛋白芯片法)和 TB-DNA在 PTB与NTM肺病鉴别诊断中有很高的敏感度、特异度和诊断符合率，而且T-SPOT.TB可以早期诊断并且快速无创，值得在临床推广。