HPLC-DAD法测定复合维生素B片中5种组分的含量

2018-08-28 06:50胡晓琴
长治学院学报 2018年2期
关键词:冰醋酸泛酸烟酰胺

胡晓琴,韩 春

(长治学院 化学系,山西 长治 046011)

复合维生素B片(Vitamin B Compound Tablets)处方源于《卫生部颁药品标准》化学药品及制剂第一册 WS1-73(B)-89[1],由维生素 B1(Vitamin B1)、维生素 B2(Vitamin B2)、烟酰胺(Nicotinamide)、维生素 B6(Vitamin B6)和泛酸钙(Calcium Pantothenate)等5种功效组分加工而成,临床用于预防和治疗B族维生素缺乏导致的营养不良、口角炎、神经系统等疾病[2]。现行质量标准《卫生部颁药品标准》化学药品及制剂第一册WS1-73(B)-89分别使用重量法测定维生素B1、分光光度法测维生素B2、滴定法测烟酰胺[1],方法操作繁琐、误差较大,并且未对维生素B6和泛酸钙进行评价。现有文献中常用高效液相色谱法或超高效液相色谱法测定维生素B1、维生素B2、烟酰胺和维生素B6含量[3-12];但未见同时测定复合维生素B片5种有效组分的报道,且对于该药中泛酸钙的含量测定报道甚少。本研究采用HPLC-DAD法,选择以乙腈缓冲液(6 mmol/L己烷磺酸钠,1 mmol/L庚烷磺酸钠混合溶液,用冰醋酸调节pH值至4.5)(20:80)为流动相,同时测定复合维生素B片5种有效组分,可为复合维生素B片质量控制提供参考。

1 实验部分

1.1 仪器与试药

岛津LC-20AT型高效液相色谱仪,配有SPD-M20A二极管阵列检测器(DAD)和LabSolutions色谱工作站(日本岛津公司)。维生素B1(批号:100390-201505,含量:100%,100 mg/支)、维生素B2(批号:100369-201504,含量:100%,100 mg/支)、烟酰胺(批号:100115-201604,含量:100%,100 mg/支)、维生素 B6(批号:100116-201404,含量:100%,100 mg/支)、泛酸钙(批号:100370-201402,含量:100%,100 mg/支)均购自中国食品药品检定研究院。复合维生素B片(山西 ****有限公司,批号:140602、140603、140604、140605、140606、140607、160102、160706);甲醇、乙腈为色谱纯,冰乙酸、无水乙醇为分析纯,盐酸为优级纯,水为超纯水。

1.2 色谱条件

色谱柱:Shim-pack VP-ODS C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:乙腈缓冲液(6 mmol/L 己烷磺酸钠,1 mmol/L庚烷磺酸钠混合溶液,用冰醋酸调节 pH 值至 4.5)(20:80);柱温:30℃;流速:1 ml/min;进样量:10 μL;检测波长:265 nm(维生素B1、维生素B2和烟酰胺)和210 nm(维生素B6和泛酸钙)。

1.3 溶液配制

对照品储备液:分别精密称取维生素B1对照品24.32 mg、维生素B2对照品12.53 mg、烟酰胺对照品80.46mg和泛酸钙对照品10.25 mg,置10 ml量瓶中,加适量1%冰醋酸,振摇溶解后定容,作为对照品储备液(1);另精密称取维生素B6对照品15.87 mg,置100 ml量瓶中,加适量1%冰醋酸,振摇溶解后定容,作为对照品储备液(2),避光低温保存。

对照品溶液:分别精密量取上述对照品储备溶液(1)1.0 ml、对照品储备溶液(2)2.0 ml,置 25 ml量瓶中,加1%冰醋酸溶液稀释至刻度,摇匀,作为混合对照品溶液。

供试品溶液:取本品20片,精密称定,研细,精密称取适量(约相当于3mg维生素B1),置50 ml量瓶中,加入1%冰醋酸 40 ml超声(300 W,45 kHz)处理15 min,放冷,用1%冰醋酸定容,用微孔滤膜(0.45 μm)过滤,避光保存。

2 结果与分析

2.1 系统适用性试验

精密吸取“1.3”项下的混合对照品溶液和供试品溶液,按“1.2”项下色谱条件进样分析,记录色谱图(如图1)。由图1可知,供试品与对照品中维生素B1、维生素B2、烟酰胺、维生素B6和泛酸钙色谱峰的保留时间相对应。维生素B1、维生素B2、烟酰胺、维生素B6和泛酸钙的保留时间分别为11.3 min、9.2 min、6.3 min、7.6 min 和 3.6 min。

图1 供试品溶液和对照品溶液色谱图

2.2 线性试验

分别精密吸取“1.3”项下对照品贮备液(1)0.05 ml、0.1 ml、0.2 ml、0.5 ml、1.0 ml分别置 5 ml量瓶中,依次加入“1.3”项下对照品贮备液(2)0.1 ml、0.2 ml、0.4 ml、1.0 ml、2.0 ml,加 1%冰醋酸定容,摇匀,得系列混合对照品溶液。按“1.2”项下色谱条件进样分析,以各组分的浓度x为横坐标,相应峰面积y为纵坐标,绘制标准曲线,得回归方程及r,同时计算5种有效组分的检测限和定量限,结果见表1。

表1 回归方程、检测限和定量限

2.3 精密度、稳定性和重复性试验

精密吸取“1.3”项下的混合对照品溶液,按“1.2”项下色谱条件连续进样6次,计算得维生素B1、维生素B2、烟酰胺、维生素B6和泛酸钙峰面积的RSD分别为0.56%、0.73%、0.48%、0.96%和0.87%,表明方法精密度良好。

精密吸取同一供试品溶液,分别于 0、2、4、8、10 h,按“1.2”项下色谱条件进样,测定峰面积,结果维生素B1、维生素B2、烟酰胺、维生素B6和泛酸钙峰面积的RSD分别为0.74%、1.08%、0.95%、1.25%和0.96%,表明供试品溶液在10 h内稳定。

取同一批次复合维生素B片(批号:140605),按“1.3”项下方法制备供试品溶液,共6份,分别进样测定,结果维生素B1、维生素B2、烟酰胺、维生素B6和泛酸钙含量的RSD分别为0.57%、0.70%、0.82%、1.16%和0.61%,色谱峰相对保留时间的RSD分别为1.08%、0.93%、0.96%、0.85%和0.47%,表明方法重复性良好。

2.4 加样回收率试验

取已知各组分含量(维生素B1、维生素B2、烟酰胺、维生素B6和泛酸钙含量分别为 3.11、1.54、10.17、0.21 和 1.04 mg/片,平均片重:0.0743 g)的复合维生素B片20片,研细,精密称取0.07 g,共18份,分别置50 ml量瓶中,依次加入“1.3”项下对照品储备液(1)、(2)0.6、1.2、2.0 ml各 6 份,按“1.3”项下方法制备供试品溶液,分别进样分析,计算回收率。结果见表2,RSD<2.7%,加样回收率均满足要求。

表2 加样回收率测定结果(%)

2.5 样品含量的测定

按“1.3”项下方法制备8个批次样品的供试品溶液,按“1.2”项下色谱条件进行测定,分别计算5种组分的含量,同时与《卫生部颁药品标准》化学药品及制剂第一册WS1-73(B)-89收载方法比较,检测结果基本相符,相对偏差在1.0%范围内,说明该方法能够满足复合维生素B中有效组分含量测定的要求,结果见表3。

表3 含量测定结果(n=3)

3 讨论

3.1 检测波长的选择

采用岛津SPD-M20A二极管阵列检测器(PDA),按本文色谱条件对混合标准溶液进行200~600 nm全波长扫描,提取5种物质的紫外吸收图谱。可知维生素B1在248、254 nm处有较强的吸收峰;维生素B2在254、267、270 nm处有较强的吸收峰;烟酰胺在254 nm处有最大吸收峰,维生素B6在210、280 nm处有较强的吸收峰,泛酸钙在210 nm处有最大吸收峰;为兼顾多种组分同时检测,并综合考虑灵敏度、分离度等因素,分别考察各波长处的色谱图,发现维生素B1、维生素B2和烟酰胺在265 nm处,维生素B6和泛酸钙在210 nm峰形好,分离度满足要求,各组分在相应保留时间处有较强吸收,色谱图见图1。所以,本试验采用了不同波长检测,维生素B1、维生素B2和烟酰胺的检测波长为265 nm及维生素B6和泛酸钙的检测波长为210 nm。

3.2 流动相的选择

试验过程中分别考察了乙腈水、甲醇水、甲醇1%冰醋酸及缓冲盐、乙腈0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液、乙腈缓冲液(己烷磺酸钠和庚烷磺酸钠混合溶液)等流动相体系,结果显示,以乙腈缓冲液(己烷磺酸钠和庚烷磺酸钠混合溶液)为流动相时的总体分离效果较好,但个别组分色谱分离度欠佳;在此基础上调整了流动相的比例、己烷磺酸钠和庚烷磺酸钠的浓度,以及缓冲液的pH值,最终选定以乙腈缓冲液(6 mmol/L己烷磺酸钠,1 mmol/L庚烷磺酸钠混合溶液,用冰醋酸调节pH值至4.5)(20:80)为流动相,等度洗脱,各色谱峰的对称性良好、分离度满足要求。

3.3 提取溶剂的考察

根据5种组分的性质,考虑到维生素B2、泛酸钙在酸性强度大时不稳定,而维生素B1酸度弱时提取不完全,对比了不同酸度的冰醋酸溶液对5种组分的提取效率,最终,选用1%冰醋酸溶液作为溶剂。

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