宁前胡内生真菌的培养分离与鉴定

刘海涛，邵 杰，王 刚，梁益敏，杨 陵，王国凯

(1.安徽中医药大学药学院 安徽道地中药材品质提升协同创新中心，安徽 合肥 230012； 2.安徽邦宁制药有限公司，安徽 宁国 242300)

植物内生菌是指其生长发育时期生活在健康植物组织内部，并不引起宿主植物出现明显病害症状的微生物，包括内生细菌和内生真菌[1]。内生真菌广泛存在于植物各个器官、组织的细胞内及细胞间隙之中，由于它们和其寄主植物长期共生，内生真菌除了产生一些独特的代谢产物外，还往往可以产生与寄主植物代谢产物相近甚至相同的具有生物活性的次生代谢产物，研究表明这些活性成分具有显著的抗菌、抗氧化、抗肿瘤等作用[2-4]。

中药前胡为伞形科植物白花前胡(P.praeruptorumDunn.)的干燥根，始载于《名医别录》，具有宣散风热、降气祛痰的功效，可用于风热感冒、咳嗽痰多、痰热喘满等症[5]。安徽省宁国市地处皖南山区天目山北麓，素以盛产道地药材白花前胡而著称。该地所产前胡以个大、皮黑、肉白、条长、柔软、香味浓等特点著称，商品市场俗称“宁前胡”[6]。目前国内外研究者对白花前胡化学成分和药理活性等进行了广泛的研究[7-9]，但尚未见有关于宁前胡内生真菌的研究报道。本研究首次从宁前胡中分离鉴定出多种内生真菌，丰富了宁前胡内生真菌的种质资源，并为进一步寻找内生真菌的次生代谢产物提供依据。

1 材料

1.1 试药 宁前胡药材于2017年6月采自安徽省宁国市港口镇株木店村，经安徽中医药大学梁益敏副教授鉴定为伞形科前胡属白花前胡(P.praeruptorumDunn.)。培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potato dextrose agar，PDA)，购于北京奥博星生物技术有限责任公司。

1.2 仪器 SPT-P250C智能生化培养箱：合肥华德利科学器材有限公司；TGL-16G台式离心机：上海安亭科学仪器厂；SW-CJ-2FD双人单面洁净工作台：苏州苏洁净化设备有限公司；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂；植物/真菌基因组DNA小量提取试剂盒：天根生化科技(北京)有限公司；T-Gradient Thermoblock PCR仪：德国Biometra公司；G-BOX凝胶成像系统Gene-Snap：英国Syngene公司；DYY-8C电泳仪：北京六一仪器厂；通用引物：内转录间隔区ITS1(5′-TC-CGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TC-CTCCGCTTATTGATATGC-3′)均由上海生工生物工程股份有限公司定制。

2 方法

2.1 内生真菌的培养分离与纯化 采用组织块法分离内生真菌。保存完好的宁前胡根部，去除须根和叶子，用蒸馏水把根部冲洗干净，用滤纸吸干表面水分，晾干。按照常规表面无菌操作法：依次用75%乙醇漂洗1～2 min，3%次氯酸钠漂洗3～5 min，75%乙醇漂洗30 s，无菌水冲洗5次。设置空白对照，用移液枪移取最后一次冲洗的无菌水200 μL，用涂布棒均匀涂布于PDA培养基的表面，倒置于恒温28 ℃培养箱中培养2～4 d，平行3份以验证灭菌效果是否彻底。然后用无菌滤纸充分吸干宁前胡表面水分，再用无菌手术刀将材料切成0.2 cm×0.2 cm长段(片)，将上述组织块分别接种于PDA培养基中，每皿4块，置28 ℃恒温培养箱中倒置培养5～15 d。观察组织块断面处向PDA培养基周围长出形态特征、颜色差异的菌落时，用无菌接种环挑取形态各异的菌丝或孢子接种于新的培养基上，培养2～4代，待纯化后转移到PDA斜面试管中编号备用。

2.2 菌株的形态学初步鉴定 将保存完好的菌株复壮到PDA培养基平板上，恒温28 ℃培养箱中培养5～10 d。内生真菌主要的形态特征包括所分得的菌落大小、表面特征、菌丝形态、产孢结构类型以及孢子的形态，参照《真菌鉴定手册》[10]进行初步鉴定分类。

2.3 菌株的分子鉴定

2.3.1 内生真菌DNA提取 将纯化的内生真菌用无菌药匙刮取表面，放入无菌研钵中，加入2～3次液氮冷冻菌丝体，然后用研杵充分研磨冷冻的菌丝体，应随时补充液氮以保持低温，参照试剂盒步骤进行操作，得到DNA溶液，置于-20 ℃冰箱保存备用。

2.3.2 rDNA-ITS的PCR扩增 扩增真菌rDNA-ITS的上游引物ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；下游引物 ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。PCR反应体系50 μL，见表1。

表1 PCR扩增rDNA-ITS的反应体系

2.3.3 PCR扩增程序和内生真菌rDNA基因的系统发育分析 PCR扩增程序：参照文献[11]中的方法，委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行PCR扩增，得到扩增产物，后将扩增产物在琼脂糖凝胶中进行电泳检测，由凝胶成像系统进行观察、拍照。检测后置于-20 ℃冰箱中保存，备用。将PCR扩增产物进行测序，将测序结果提交至GeneBank数据库，与相关种属序列进行同源性比较，并进行系统发育树分析。利用美国国家生物技术信息中心(national center of biotechnology information，NCBI)数据库BLAST对序列进行相似性分析，对菌株进行鉴定，从而得到真菌的分类地位，构建系统发育树。

2.4 分析方法 定植率(colonization rate，CR)=受内生真菌侵染的组织块数/全部供试样本组织块数×100%。内生真菌的CR可以反映宿主植物受内生真菌侵染的程度[12]。分离频率(separation frequency，SF)=分到内生真菌各属的分离数/分到内生真菌分离总数×100%。SF>10%的属定义为某样区的优势属，5%≤SF≤10%定义为常见属，SF<5%定义为稀有属。相对分离频率(relative separation frequency，RSF)=分离的某种内生真菌的菌株数/分离的总菌株数×100%。RSF可以用来计算植物组织中某种真菌的优势度[13]。

3 结果

3.1 宁前胡内生真菌的分离 两个批次共120个组织块来源于6株白花前胡植株样本，有96个组织块不同程度上侵染有内生真菌，CR为80%。通过组织块法从宁前胡中共计分离得到41株内生真菌，分属于10属21种。Fusarium12株，Penicillium8株，Aspergillus4株，Alternaria8株，Tricladium1株，Phoma1株，Collariella1株，Rhizoctonia2株，Colletotrichum1株，Trichoderma3株。

3.2 形态学鉴定 内生真菌通过菌落特征比对和显微观察，LH03、LH06、LH10、LHT16、LHT19表面菌丝相对密集，棉絮状，有大量分生孢子，分生孢子梗集结成分生孢子座，细长，分枝，大孢子弯曲呈不明显的镰刀形，小型孢子为长卵圆形。LH02、LH04、LH07、LHT15菌落生长初期为白色，逐渐变为绿色或墨绿色，粉状，孢子梗直立，顶端一至多次分枝，形成扫帚状，分枝顶端生瓶状小梗，顶端生成串的分生孢子。LHT17、LHT20、LHT21菌丝密集，由白色渐变为墨绿色，气生菌丝不发达，菌丝有隔膜，分生孢子倒棍棒形，椭圆形或卵圆形，顶端有噱状细胞和砖隔状的分生孢子。LH09、LH11菌落表面初期为白色，逐渐变为深褐色，生成众多的小颗粒状孢子团，产大量黑色或褐色孢子粉，分生孢子串生、无色，有球形或卵圆形的。LH01、LHT14菌落初为白色，生长迅速，菌丝多为基内生菌丝，渐变为绿色，具有透明的瓶梗，分生孢子一般光滑，典型形状为椭圆形至近似长方形，很少为球形，大多数为绿色或者透明。根据魏景超[10]编著的《真菌鉴定手册》，将LH03、LH06、LH10、LHT16、LHT19初步鉴定为镰孢霉属(Fusarium)；LH02、LH04、LH07、LHT15初步鉴定为青霉属(Penicillium)；LHT17、LHT20、LHT21初步鉴定为链格孢属(Alternaria)；LH09、LH11初步鉴定为曲霉属(Aspergillus)；LH01、LHT14初步鉴定为木霉属(Trichoderma)；菌株LHT12因不产孢子，形态和显微鉴定没有意义，故通过分子生物学鉴定。初步鉴定为镰孢霉属、青霉属、链格孢属、曲霉属和木霉属，5个属的形态与显微形态特征见图1。

3.3 分子生物学鉴定

3.3.1 PCR扩增产物电泳结果 对分离得到的21种内生真菌进行DNA提取，得到DNA提取液，进行rDNA-ITS序列扩增，550 bp左右处出现一条单一明亮的条带，见图2。

图1 内生真菌菌落及显微结构

注：M.marker；1. LH1；2. LH2；3. LH3；4. LH4；5. LH5；6. LH6；7. LH7；8. LH8；9. LH9；10. LH10；11. LH11；12. LHT12；13. LHT13；14. LHT14；15. LHT15；16. LHT16；17. LHT17；18. LHT18；19. LHT19；20. LHT20；21. LHT21

图2内生真菌16 S rDNA的PCR产物凝胶电泳图

3.3.2 rDNA-ITS序列比对以及系统发育树的构建 登陆NCBI网站(www.ncbi.nlm.nih.gov)，将测序结果与Genbank数据库中已知序列进行比对分析，结果见表2。

表2 分离纯化得到白花前胡内生真菌及鉴定结果

利用MEGA 4.0和Clustal X软件对表2中21种rDNA-ITS分子序列构建系统发育树，结果见图3。

由表2和图3可知，宁前胡内生真菌分布于10个属中，其种类资源非常广泛。主要分布于Fusarium、Penicillium和Alternaria属中，占其总数的68.29%。分布最广的为Fusarium，共有12株，其RSF为29.27%。而Fusarium中的F.tricinctum和F.verticillioides为其优势种，其RSF分别为9.76%和7.32%。菌株LHT12通过分子生物学鉴定为Rhizoctoniabataticola，共有2株，其RSF为4.88%。

图3 宁前胡内生真菌ITS序列系统发育树

4 讨论

药用植物内生真菌长期生活在植物体内的特殊环境，其在演化过程中两者形成了互惠共生关系，已有研究结果显示，内生真菌的多样性受生境的影响显著，不同产地的同一种药用植物中内生真菌的群落结构存在较大的区别[14]。查阅文献发现，对伞形科植物内生真菌研究较少，本研究对安徽道地药材宁前胡内生真菌进行培养分离与鉴定，结果显示分布最广的类群是镰孢霉属Fusariumsp.，SF为29.27%，为其优势种属。镰孢霉属广泛存在于自然界中，在霍山石斛[15]、亳芍[16]、海南粗榧[17]等植物中广泛存在，能产生重要的活性成分。本研究共分离鉴定5种镰孢霉属真菌，分别为unculturedFusarium、F.oxysporum、F.tricinctum、F.verticillioides和F.proliferatum。本研究后期将对宁前胡内生真菌优势种属的次级代谢产物进行研究，以期从中寻找到具有生物活性的先导化合物。