福建省人感染H5N6禽流感病毒与外环境禽流感病毒相关性分析

陈 平,谢剑锋,,林 琦,赵 琳,张炎华,陈宏彬,翁育伟,,郑奎城,

禽流感病毒属于正粘病毒科的甲型流感病毒属,是重要的人兽共患病病原.不同亚型的禽流感病毒在不同地区禽类中流行,进行基因重配,近年来已造成人感染禽流感病例的不断出现[1-2].依据病毒对禽类的致病指数可分为高致病性和低致病性禽流感病毒.1975年,在美国首次从绿头鸭体内分离出高致病性H5N6禽流感病毒[3],我国则最初于2014年3月在广东省患病的鸭群中分离得到[4].此后,H5亚型逐渐成为我国南方禽中主要流行的高致病性病毒[5],这不仅造成大量的活禽发病与死亡,2014年我国还出现了人感染H5N6的死亡病例[6].2017年12月,三明市报告了福建省首例人感染H5N6禽流感病例,也是我国第19例人感染H5N6病例[7].经流行病学调查证实:人感染H7N9、H5N6、H5N1等禽流感主要来源于禽类场所[8-10].由此,本文旨在分析福建省外环境禽流感病毒H5亚型的分布情况及与人感染H5N6禽流感病毒的相关性,为人感染H5N6禽流感的防控提供科学依据.

1 材料与方法

1.1 材料 从福建省禽流感环境监测和暴露人群血清监测子系统下载2013－2017年福建省外环境标本信息和禽流感病毒监测结果.从中国流感病毒基因序列数据库和GISAID数据库下载福建省人感染H5N6禽流感病毒基因序列和2013－2017年相关禽类及外环境禽流感毒株序列.在首发的人感染H5N6禽流感病例家中的鸡舍采集外环境加强监测标本.

1.2 方 法

1.2.1 外环境监测结果分析 下载相关数据信息后整理并建立Excel数据库,采用SPSS 20.0进行卡方检验,分析外环境不同网络实验室(福州、厦门、泉州、漳州、三明、南平)、监测场所(城乡活禽市场、家禽规模养殖场(户)、家禽散养户集中的地区、家禽屠宰加工厂、野生禽鸟栖息地)、标本种类(水标本、笼具表面擦拭标本、宰杀或摆放禽肉案板表面的擦拭标本、粪便标本、清洗禽类的污水、禽类饮用水)、不同季度的甲型禽流感和H5亚型阳性检出率的差异性,P＜0.05为差异有统计学意义.

1.2.2 同源性分析 通过MEGA6.0软件将福建省首例人感染H5N6病毒的8个节段基因序列与福建省外环境中H5N6禽流感病毒基因序列进行逐一比对分析,分析其同源性.

1.2.3 系统进化分析 将下载的序列在 MEGA6.0上采用常规邻接法(Neighbor Joining,NJ)构建福建省H5N6禽流感病毒HA和NA基因核酸序列系统进化树(Bootstrap＝1000).研究过程中,删除相同年份具有较高同源性并且位于进化树相同终末分支上的序列.

1.2.4 统计分析 采用SPSS 20.0软件对所得数据进行相关资料的描述和分析.用χ2检验进行率的比较,P＜0.05为差异有统计学意义.

2 结 果

2.1 外环境监测情况 2013－2017年福建省共采集4 903份外环境标本,甲型禽流感、H5亚型阳性检出率分别为31.92%、4.24%,且在不同网络实验室(χ2＝101.033)、监测场所(χ2＝45.526)、标本类型(χ2＝31.751)以及时间(χ2＝48.174)上存在统计学差异(P＜0.05).通过6个监测点(福州、厦门、泉州、漳州、三明、南平)分析发现,三明H5亚型检出率最大,为9.83%.城乡活禽市场H5亚型阳性检出率最高,为5.26%,其次为家禽屠宰加工厂,而其余监测场所的检出率均较低,说明城乡活禽市场的H5亚型污染最为严重.宰杀或摆放禽肉案板表面的H5亚型阳性检出率最高,为7.66%,粪便标本、笼具表面擦拭标本、禽类饮水、清洗禽类的污水标本 H5检出率分别为3.24%、2.81%、4.95%、5.98%,由此看出H5亚型在不同的标本类型中普遍存在.从时间分布上看,H5亚型在第一和第四季度较其它两个季度的检出率高,分别为5.39%、6.41%.说明冬春季是外环境中H5亚型的检出率高峰(详见表1).

表1 2013－2017年福建省外环境禽流感病毒监测情况分析Tab.1 Surveillance results of environmental avian influenza viruses in Fujian Province,during 2013－2017

表1 (续)

2.2 同源性分析 在首例病例家中的鸡舍中采集的粪便标本中分离得到一株H5N6禽流感,命名为:A/Environment/Fujiansanyuan/08/2017,通过测序获得其HA和NA基因全长序列,经比对发现福建首例人感染H5N6禽流感病毒(A/Fujian-Sanyuan/21099/2017)与其HA和NA的核苷酸序列同源性分别高达100.0%和99.9%,与其余6株2016年外环境H5N6禽流感病毒HA、NA和NP基因亦存在较高同源性,均在91.8%以上,尤其NA基因的同源性最高,达95.7%以上;其余5个内部基因节段的同源性相对较低,在85.1%～91.9%之间.具体见表2.

表2 A/Fujian-Sanyuan/21099/2017与福建省外环境H5N6禽流感病毒核酸同源性比较(%)Tab.2 Homology analysis of nucleotide sequences between A/Fujian-Sanyuan/21099/2017 and environment isolates of influenza A(H5N6)viruses in Fujian Province

2.3 系统进化分析 将A/Fujian-Sanyuan/21099/2017与7株福建外环境H5N6禽流感病毒株以及其他地区相关的禽流感病毒基因序列绘制进化树图,见图1.结果显示:福建省人感染H5N6禽流感病毒与A/Environment/Fujiansanyuan/08/2017病毒进化距离最接近,而与其余6株外环境H5N6禽流感病毒的HA基因处于于不同进化分枝中.A/Fujian-Sanyuan/21099/2017与长江三角洲地区的H5亚型,尤其是H5N8亚型聚集在同一分支中,具有更高的相似性,而相对于2005年三明报道的首例人感染H5N1病例毒株(A/Fujian/1/2005)序列,在进化树中处于较远的距离.在NA基因进化树中,A/Fujian-Sanyuan/21099/2017与福建省的7株外环境H5N6禽流感病毒均处于同一进化树分枝,具有较高的亲缘性.由此说明,福建省人感染H5N6禽流感病毒的HA和NA基因可能是分别由长江三角洲地区的H5N8亚型与福建省的H5N6亚型进化而来.

图1 福建省H5N6禽流感病毒HA和NA基因序列系统进化树Fig.1 Phylogenetic analysis of HA and NA genes of the avian influenza A(H5N6)viruses isolated in Fujian Province

3 讨 论

人感染禽流感疫情发生的主要源头是外环境禽流感病毒的污染[9].自2013年以来,H5N6亚型禽流感病毒在我国南部(江西、广东)和西部(四川)的家禽中传播流行[4].2014年,中国、老挝和越南的家禽发生了H5N6禽流感病毒感染暴发[11],同年4月,在我国四川省首次发现1例人感染H5N6禽流感病例[12],12月广东省再次报道确诊1例患者[13].福建省于2017年12月首次发现1例人感染H5N6禽流感确诊病例.本研究显示,2013－2017年,福建省6个外环境监测哨点都普遍存在甲型禽流感病毒及H5亚型的污染,表明福建省外环境中H5亚型禽流感病毒广泛存在,且阳性的检出率在冬春季较高,这与人感染禽流感的发生具有季节性相符[14].应重视外环境H5阳性率较高的局部地区禽流感防控工作.

自1996年首次在我国广东省发现H5N1亚型病毒以来,就不断有高致病性H5亚型禽流感病毒从禽类中分离出[15].研究发现,H5N1亚型从2008年开始逐渐进化演变为具有不同神经氨酸酶的新型重配H5Nx病毒[16].韩国首次报道了H5N8亚型禽流感病毒[17],随后扩散到东亚、北美洲及欧洲等地[18].H5N8与 H5N6相似,都属于 2.3.4.4分枝[19].本研究通过对福建省8株H5N6禽流感病毒基因系统进化树的构建发现,人感染H5N6禽流感、加强监测标本的HA基因与长江三角洲的H5亚型,尤其是H5N8亚型处于同一进化簇中.与我们的研究相似的是Song BM等人发现从野鸟与家禽中分离出的H5N6、H5N8亚型密切相关[20].韩国的一项研究也揭示:从侯鸟分离出的H5N6、H5N8亚型的8个基因节段同源性高达98%～100%[21].对于NA基因,福建省的8株毒株处于相同进化簇中.此外,我们还发现7株外环境的HA、NA基因并不具有明显的地域特征,可能是由于福建地处长江三角洲与珠江三角洲之间,具有特殊的地理位置,从而没有受到某一特定地区的主导影响.此外,通过8个节段的基因同源性验证发现,福建省2017年发现的人感染H5N6禽流感病毒与病家采集的加强监测标本的HA和NA基因序列几乎完全一致,可以判断人感染病例的H5N6病毒来源于自家活禽或被活禽污染的环境.该病毒全基因序列与2016年福建省外环境H5N6病毒具有一定的同源性,且HA基因与2005年三明市报告的首例人感染H5N1禽流感病毒在进化中处于较远距离,进一步得出人感染H5N6禽流感病毒可能与外环境长期存在的H5N6病毒有关,且病毒存在一定的变异变迁,可进一步通过分析全基因的遗传进化特征来描述病毒可能的变异重组情况.

本文通过对外环境甲型禽流感病毒、H5亚型的监测,以及8株H5N6毒株进行分析,探讨人感染H5N6禽流感与外环境的关联性.福建省的人感染H5N6禽流感病毒来源于外环境中,且可能与长江三角洲地区的H5N8亚型及本省的H5N6亚型病毒重配有关.不同亚型的禽流感病毒之间不断重配产生新型重组病毒,是重要的公共卫生问题,因此,对于外环境的监测不可忽视.