大蒜素联合5-FU对结肠癌HT-29细胞凋亡的影响及机制

邵佳月 孙秀威

结肠癌是癌症死亡的第二常见原因[1]。结直肠癌化学治疗的主要用药是5-fluorouracil(5-FU)和奥沙利铂。结肠癌有较高的复发率和转移率。II期结肠癌患者手术后的复发率约20%～30%。此外，一些III期癌症患者接受化学治疗无效，所以尝试联合用药迫在眉睫。大蒜素是大蒜的主要活性成分之一，是大蒜中最具生物活性的化合物之一，大蒜具有多种生物活性，包括抗动脉粥样硬化，降压、抗菌、抗癌、免疫调节、抗辐射以及潜在的抗衰老作用[2-3]。大蒜素是新鲜大蒜的主要成分，是由蒜氨酸通过酶作用形成的[4-5]。大蒜素对胃癌、结肠癌、肝癌、肺癌等多种肿瘤细胞有明显的抑制作用，已作为临床辅助药物进入临床治疗，激活凋亡信号通路可能是治疗恶性肿瘤的有效途径，但大蒜素发挥其凋亡作用的机制尚不完全清楚[6]。鉴于结肠癌的高发病率及大蒜素在肿瘤治疗中的重要作用，本实验旨在探讨大蒜素与5-FU联合应对结肠癌HT29细胞的生长抑制和诱导凋亡作用机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

青霉素、链霉素和胰酶购自Hyclone公司；胎牛血清、1640培养液与HT29细胞购自上海中桥新舟公司；CCK-8试剂盒购自日本Dojindo公司；大蒜素购自大连美伦公司；5-FU购自Sigma公司；光学显微镜购自日本Olympus公司；酶标仪购自瑞士TECAN公司；Direct DetectTMSpectrometer-Sample Measuring红外微定量分析仪购自德国Merck Millipore公司；实时荧光定量PCR仪购自德国Roche公司。

1.2 细胞培养

将结肠癌HT29细胞株置于含10% FBS及1%双抗的1640培养基中，置于含5% CO2、37℃饱和湿度的CO2培养箱中培养，2～3天换一次液，待细胞铺满培养瓶底面积80%以上对细胞进行传代，采用对数生长期的细胞进行后续实验。

1.3 CCK-8检测HT29细胞增殖情况

收集对数生长期HT29细胞，以每孔4 000个加入96孔板，每孔100 μL。将不同质量浓度(2～30 μg/mL)的药物(5-FU、大蒜素)各100 μL加入实验孔，另设立不加药的阴性对照。每一浓度设4个复孔，培养48 h。每孔加入10 μL的CCK-8继续孵育3 h，酶标仪检测490 nm处吸光度值。

1.4 流式细胞术检测HT29细胞凋亡情况

取对数生长期HT29细胞，接种于6孔板待细胞平铺于瓶底80%～90%后，将不同质量浓度(2～30 μg/mL)的药物(5-FU、大蒜素)各1000 μL加入实验孔，另设立不加药的阴性对照。每一浓度设4个复孔，培养48 h后，用不含EDTA的胰酶消化后收集细胞，用预冷PBS重悬细胞一次，2 000 rpm离心5～10 min，弃上清洗涤细胞；加入300 μL的1×Binding Buffer悬浮细胞，将细胞浓度调整至5×106/mL；取195 μL细胞悬液，加入5 μL的Annexin V-FITC混匀后，避光，室温孵育15 min；上机前5 min再加入5 μL的PI染色，补加200 μL的1×Binding Buffer。

1.5 实时PCR检测HT29细胞中相关mRNA表达

将HT29细胞平铺于24孔培养板，待细胞融合至80%左右将细胞随机分为空白对照组、大蒜素组、5-FU组、大蒜素+5-FU组，加药后继续培养48 h，弃上清液，PBS洗两次，收集不同组别的HT29细胞加入TRIzol裂解液，提取总RNA，并按照逆转录试剂盒的说明将提取的总mRNA逆转录成cDNA，用于实时定量PCR检测，采用标准曲线法计算mRNA相对量。

引物序列由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列：PTEN：5-ACACCGCCAAATTTAACTGC-3，5-TGAGGTTTCCTCTGGTCCTG-3；mTOR：5-GATTCTCACAACCCAGCGTG-3，5-CGTTAAGGATCAACAAGGCT-3；Bcl-2：5-ATTGGGAAGTTTCAAATCAGC-3，5-TGCATTCTTGGAC GAGGG-3；Bax：5-TTTTGCTTCAGGGTTTCATC-3，5-GACACTCGCTCAGCTTCTTG-3；GAPDH：5-ATCACCATCTTCCAGGAGCGA-3，5-GCCAGTGAGCTTCCCGTTCA-3。

1.6 统计分析

2 结果

2.1 大蒜素联合5-FU对HT29细胞增殖抑制作用的影响

分别加入质量浓度为2，5，10，15，20，25，30 μg/mL大蒜素、5-FU与5-FU联合大蒜素处理HT29细胞48 h。CCK-8法检测其对HT29细胞增殖作用影响结果显示，不同浓度的大蒜素对HT29细胞抑制作用随着浓度的增加抑制作用逐渐增大，差异具有统计学意义；不同浓度的5-FU对HT29细胞抑制作用随着浓度的增加抑制作用逐渐增大，差异具有统计学意义；不同浓度大蒜素+5-FU对HT29细胞抑制作用随着联合浓度的增加抑制作用逐渐增大；与相应浓度大蒜素和5-FU单独浓度比较，大蒜素+5-FU组对HT29细胞抑制作用明显大于大蒜素组和5-FU组，差异具有统计学意义。后续实验选取大蒜素、5-FU与5-FU联合大蒜素终浓度均为15 μg/mL(表1)。

2.2 大蒜素联合5-FU对HT29细胞凋亡情况的影响

流式细胞术检测结果显示，与空白对照组比较，大蒜素组、5-FU组和大蒜素+5-FU组均能够促进HT29细胞的凋亡，差异具有统计学差异(P<0.01)；与大蒜素组和5-FU组比较，大蒜素+5-FU组能够明显促进HT-29细胞的凋亡，差异具有统计学意义(P<0.05)(图1，表2)。

图1 HT29细胞凋亡情况Figure 1 Apoptotic cells were determined in HT29 cells by flow cytometry

表1 大蒜素与5-FU对HT29细胞增殖抑制率

2.3 大蒜素联合5-FU对HT29细胞mTOR、PTEN、Bcl-2与Bax mRNA表达的影响

与空白对照组比较，大蒜素组、5-FU组和大蒜素+5-FU组处理的HT29细胞中PTEN和Bax mRNA的表达明显增加，mTOR和Bcl-2的mRNA的表达明显降低，差异均具有统计学意义(P<0.05)；与大蒜素组、5-FU组比较，大蒜素+5-FU组中PTEN和Bax的mRNA的表达明显增加，mTOR和Bcl-2的mRNA的表达明显降低，差异均具有统计学差异(P<0.05)(表3)。

表2 各组细胞凋亡率的比较Table 2 The apoptosis rates in each

表3 HT29细胞中mTOR、PTEN、Bcl-2与Bax表达Table 3 The expression of mTOR，PTEN，Bcl-2 and Bax mRNA in HT29

3 讨论

结肠癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，目前主要采用手术、放化疗和靶向治疗。5-FU和蒽环类是常用于治疗结肠癌的化疗药物，但疗效往往不佳，容易产生耐药性，主要原因是肿瘤对化疗药物产生的抵抗反应，因此本实验尝试大蒜素与5-FU联合应用来达到低毒高效的目的。

大蒜素是一个最畅销的草药产品，是有机含硫化合物的天然来源，最近研究最多的是关于它们的治疗应用。作为大蒜的活性成分，大蒜素具有广泛的药理活性包括抗癌、抗血小板、抗菌、降血脂和预防作用[7]。大蒜素对胃癌、结肠癌、肝癌、肺癌等多种肿瘤细胞有明显的抑制作用，已作为辅助药物进入临床治疗，激活凋亡信号通路可能是治疗恶性肿瘤的有效途径。

研究表明，Bcl-2家族成员(如Bax、Bcl-xL、Mcl-1、Bcl-2)位于线粒体膜，线粒体膜的通透性改变引发caspase激活，从而导致细胞凋亡[8]。在非caspase依赖的凋亡途径中发现大蒜素诱导人上皮癌细胞凋亡通过线粒体释放诱导因子(AIF)和蛋白激酶A[9]。PTEN、PI3K涉及信号转导通路在细胞生长和死亡调控中的核心作用[10]，其通路是癌细胞转移潜能的基础，为靶向PI3K/Akt通路提供了有力的理论依据[11]。PTEN基因是PI3K/Akt信号通路的负调控因子[12]。而mTOR是一个集成了生长因子和激素的多个信号的丝氨酸/苏氨酸激酶，其控制细胞生长、增殖、血管生成[13]。mTOR调控细胞生长，在PI3K/Akt/mTOR信号通路中处于中心地位。mTOR可通过调控蛋白质磷酸化过程，促进细胞增殖与分化[14]。PTEN通过抑制PI3K/Akt信号通路 反向调节mTOR，Akt磷酸化上调mTOR活性，失调的mTOR参与肿瘤形成、血管生成和耐药[13]。一般癌症患者中mTOR信号通路的激活与肿瘤分化程度及预后息息相关，而表皮生长因子和PTEN通路能够抑制其作用[15]。肿瘤细胞无限制生长的重要原因就是其生理性和主动性凋亡的能力的丧失，因此有效的抗肿瘤药物治疗不仅要抑制肿瘤细胞增殖，而且要诱导肿瘤细胞凋亡。

体外细胞试验显示，5-FU与大蒜素联合对比单独用药可以提高HT29细胞凋亡率。基因水平检测显示5-FU与大蒜素联合应用可以通过下调Bcl-2表达与上调Bax表达诱导细胞凋亡。大蒜素与5-FU联合下调mTOR表达，提高抑癌基因PTEN基因表达，对比单独给药具有统计学差异。

综上所述，大蒜素有促进5-FU对HT29细胞的致凋亡作用，能增加HT29细胞对化疗药物的敏感性，对结肠癌的治疗以及预后都起着积极的作用，值得进一步进行临床研究。