补肾化瘀方对多囊卵巢综合征大鼠血清25羟基维生素D3、AMH、T、INS及E2的影响

黄威　鲁耀邦　熊桦　崔培梧

〔摘要〕 目的 研究补肾化瘀方对多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）模型大鼠血清25羟基维生素D3[25-（OH）VD3]、抗苗勒管激素（AMH）、血清睾酮（T）、胰岛素（INS）及雌二醇（E2）的影响。方法 61只SD雌性大鼠随机选取8只设为空白组，剩余大鼠采用来曲唑灌胃法建立PCOS大鼠模型。成模后大鼠随机分为模型组、中药组及西药组，给予相应药物干预后腹主动脉取血。采用酶联免疫吸附法测定药物干预后各组大鼠血清激素[25-（OH）VD3、AMH、T、INS、E2]含量，分析各组血清激素水平的差异。结果 空白组、中药组以及西药组的血清E2与25（OH）VD3浓度高于模型组，差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01），而AMH与INS浓度均低于模型组，差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。结论 补肾化瘀方对灌服来曲唑所致PCOS模型大鼠血清AMH、INS、25（OH）VD3与E2等激素水平有调节作用，能有效改善PCOS的无排卵、卵泡发育停滞及糖脂代谢紊乱等问题。

〔关键词〕 多囊卵巢综合征；25羟基维生素D3；抗苗勒管激素；睾酮；胰岛素；雌二醇

〔中图分类号〕R271；R285.5 〔文献标志码〕A 〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.06.009

〔Abstract〕 Objective To study the effect of Bushen Huayu decoction on serum vitamin D3， adrenal medullary hyperplasia （AMH）， testosterone （T）， insulin （INS） and estradiol （E2） in polycystic ovary syndrome （PCOS） rats. Methods Eight rats were randomly selected from 61 SD female as the blank group. The remaining rats by gastric perfusion of letrozole were to establishment of PCOS rat models. After modeling， the rats were randomly divided into the model group， the Chinese medicine group and the Western medicine group. The blood of abdominal aorta was taken after the intervention of the corresponding drug intervention. The serum levels of 25（OH）VD3， AMH， T， INS， and E2 in each group after drug intervention were measured by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. The difference of serum levels in each group was analyzed. Results The concentrations of serum E2 and 25（OH）VD3 in the blank group， the Chinese medicine group and the western medicine group were higher than those in the model group， the results were significantly different （P<0.05 or P<0.01）. The serum AMH and INS concentrations in the three groups were lower than those in the model group， which were significantly different （P<0.05 or P<0.01）. Conclusion Bushen Huayu decoction can regulate the levels of AMH， INS， 25 （OH）VD3 and E2 in the serum of letrozole-induced polycystic ovary syndrome（PCOS） rat models， which can effectively improve PCOS's anovulatory， follicular development stagnation and disorder of glycolipid metabolism.

〔Keywords〕 polycystic ovary syndrome； 25 （OH） VD3； anti-miillerian hormone； T； INS； E2

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）已成为妇科临床常见内分泌及代谢紊乱性疾病。该病在育龄妇女中发病率为5%～10%，导致无排卵性不孕的机率为75%，目前其发病率呈现逐年上升的趋势[1]。补肾化瘀方为尤昭玲教授治疗PCOS患者的经验方，临床案例及动物实验均显示其能有效改善PCOS[2-3]。近年来，有研究表明PCOS患者的血清25（OH）VD3水平偏低[4]，而抗苗勒管激素（AMH）水平是正常女性2～3倍[5]。本实验通过研究补肾化瘀方对PCOS模型大鼠血清25羟基维生素D3[25-（OH）VD3]、抗苗勒管激素（AMH）、睾酮（T）、雌二醇（E2）、胰岛素（INS）水平的影响，探讨补肾化瘀方改善PCOS的作用机制。

1 材料

1.1 仪器

TGL16M型高速低温离心机（湖南湘立科学仪器有限公司）、海尔-86 ℃超低温冰箱（海尔公司）、 SC-316（商流）冷藏冰箱（海尔公司）、ELx800酶标仪（美国宝特Bio-Tek公司）。

1.2 药品与试剂

来曲唑（批号：16113057，规格：25 mg/片，江苏恒瑞医药股份有限公司）、补肾化瘀汤每剂含生药85 g（处方调整为紫石英15 g，补骨脂8 g，泽兰8 g，菟丝子8 g，泽泻8 g，桑寄生8 g，土鳖虫8 g，覆盆子8 g，茺蔚子5 g，三七3 g，莲子心3 g，甘草3 g），以上两种药物均购自湖南中医药大学第一附属医院；炔雌醇环丙孕酮片（达英-35）（批号：331B，规格：2 mg/片，拜耳医药保健有限公司广州分公司）购自养天和大药房；AMH、T、E2、25（OH）VD3、INS检测免疫试剂盒均由上海纪宁实业有限公司提供；水合氯醛由天津市科密欧化学试剂有限公司提供。

1.3 动物

60日龄的SPF级雌性SD大鼠61只，体质量（226.690±0.008） g，许可证号SCXK（湘）2014-0011，饲料垫料均由长沙市天勤生物技术有限公司提供，于湖南中医药大学实验动物中心动物房饲养。

2 方法

2.1 PCOS大鼠模型建立

随机选取53只SD雌性大鼠，按照8 mL/kg剂量灌服浓度为0.125 mg/mL的来曲唑—羧甲基纤维素溶液[6]，每天1次，共21 d。其余8只按照8 mL/kg（大鼠体质量）的剂量同期灌服1%羧甲基纤维素水溶液，每天1次，共21 d。随机取3只造模大鼠，通过观察光镜下卵巢组织形态验证模型是否成功。

2.2 药物干预

剩余模型大鼠随机分为三组，模型组16只大鼠按1 mL/150 g灌服生理盐水；中药组17只大鼠按1 mL/150 g灌服1.32 g/mL中药汤液；西药组17只大鼠按1 mL/150 g灌服0.0317 mg/mL达英-35。空白组8只大鼠按1 mL/150 g灌服生理盐水。四组均为1次/d，连续灌服3 d后停药1 d，为1周期。共16个周期。

2.3 标本采集

药物干预结束后，停食1 d。用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后腹主动脉取血，待血液凝固后，4 500 g， 低温离心5 min，取上清冻存于-85 ℃冰箱备用。

2.4 血清指标检测

将冻存的血清（空白组5只，模型组、中药组、西药组6只）于4 ℃冰箱解冻，采用酶联免疫吸附法，按试剂盒说明书操作分别检测血清25（OH）VD3、AMH、T、INS、E2等激素水平；每个样本平行测量3次后取均值。

2.5 统计学方法

使用SPSS 17.0软件对数据结果进行统计分析，计量数据用“x±s”表示。组间差异比较采用单因素方差分析，两两比较方差齐时采用LSD检验，方差不齐时采用Dunnetts T3检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 PCOS大鼠模型验证

肉眼观察模型大鼠的卵巢表面泛白；光镜下查看卵巢组织形态：卵泡发育停滞且卵巢呈多囊性扩张，卵泡内未见卵细胞为空卵泡，另见大量小窦状卵泡集聚，符合多囊卵巢综合征的卵巢组织形态病变，表明造模成功。见图1。

3.2 各组大鼠血清激素检验结果

与空白组比较，模型组血清25（OH）VD3、E2水平均降低，AMH、INS水平均升高，差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）；与模型组相比，中药组、西药组的血清激素25（OH）VD3、E2浓度均升高，而血清AMH、INS浓度均降低，差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）；与模型组比较，其他3组的血清激素T浓度差异均无统计学意义（P>0.05）。西药组与中药组比较，血清各激素水平差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

4 讨论

当前，PCOS已成为妇科临床最为常见的内分泌及代谢紊乱性疾病之一，其不仅导致育龄期妇女不孕不育，还能增加患者罹患心脑血管疾病和妇科肿瘤的风险[7]。因该病的病因病机较为复杂且病患的症状表征具有高度特异性，目前对于该病尚未有明确的治疗方针。短期内治愈该病的几率极低，大多数的治疗方案是从调节患者激素紊乱，改善PCOS症狀着手。PCOS的重要表现为卵巢病变，而在卵泡发育过程中，AMH的抑制作用可导致卵泡发育停滞和无排卵现象的发生[8]。近年来，AMH检测在妇科临床上具有重要意义，特别是在辅助诊断PCOS与药物疗效方面[9-11]。目前研究显示，PCOS患者除内分泌紊乱外，还存在糖、脂及蛋白质代谢紊乱问题[12]。而25（OH）VD3参与糖脂代谢过程，另有一些研究表明，维生素D的缺乏可能是PCOS的病因之一[13-15]。

本次实验结果表明：与模型组相比，中药组与西药组的大鼠血清AMH及INS水平显著性下降，差异具有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。而25（OH）VD3与E2水平与之相反，中药组和西药组血清激素较模型组显著上升，差异具有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。虽然模型组与其他三组的血清T水平差异无统计学意义（P>0.05），但模型组的血清T水平均高于其他三组，值得关注的是，中药组血清T水平与空白组相近。通过该实验结果可以看出，中药组的激素水平与空白组更为接近，说明补肾化瘀方在调节激素水平方面较西药治疗有较大的优势。

综上所述，补肾化瘀方改善PCOS的作用机制可能与调节PCOS模型大鼠体内T、INS、E2水平，促进排卵，诱导卵细胞生长发育；降低AMH水平，促进卵泡发育，增加优势卵泡；升高25（OH）VD3水平，改善PCOS导致的糖脂代谢紊乱相关问题有关。当然，要探讨更深层次的作用机制尚需进行代谢组学、基因组学及蛋白质组学等后续的实验研究。

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