杭白芷种质资源遗传多样性的SSR分析

刘倩倩　叶浩婷　李放　王荣婷　田恩伟

摘要：[目的]分析杭白芷种质资源的遗传多样性，为其可持续利用及品种选育研究提供理论依据。[方法]从已发表的18对白芷同属植物当归（Angelica sinensis）sSR引物中，筛选出6对具有较高多态性的引物，对3个杭白芷种群[KZ（昆明）、NZ（南京）和XY（咸阳）]的53份种质材料进行PCR扩增，根据其基因型数据，分别采用Genepop 4.0、GenALEx6.4.1和Structure 2.2进行遗传多样性、遗传差异及聚类分析。[结果]6个SSR位点共扩增出37.0个等位基因，平均每个位点的等位基因数（Na）6.2个、有效等位基因数（Ne）1.798个，Shanon信息指数（I）1.802，观测杂合度（Ho）0.245，期望杂合度（He）0.304，基因流（Nm）为1.340。3个种群的遗传多样性存在一定差異，其中KZ种群遗传多样性最高（Na 3.8个，Ho 0.481，He 0.508）。3个杭白芷种群可聚类分成两组，KZ种群独成一组，NZ种群和XY种群聚为一组，表明XY种群与NZ种群亲缘关系较近。XY种群与NZ种群间的遗传分化指数（FST）较低（0.208），表明二者遗传分化程度较低，遗传差异较小；KZ种群与NZ种群和XY种群间的FST较高（0.510和10.506），表明KZ种群与NZ种群和XY种群遗传分化程度较高，遗传差异较大。[结论]同属不同种的SSR引物具有一定通用性。不同来源地的杭白芷种群间存在一定程度的遗传分化，但总体遗传多样性较低，应加大力度寻找其近缘野生资源，保障白芷种质资源的可持续利用。

关键词：杭白芷；SSR；遗传多样性；遗传分化；聚类分析

中图分类号：$567.024 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）03-0418-06

0引言

[研究意义]杭白芷[Angelica dahurica vat.for-mosona]为伞形科当归属药用植物，是白芷正品基原之一，具有解表散寒、祛风止痛、宣通鼻窍、燥湿止带、消肿排脓等功效（国家药典委员会，2015）。据《中国植物志》记载，杭白芷主要在我国浙江杭州等地栽培种植，至今尚未发现野生种分布。目前，含白芷的成方制剂有600余种，国内外市场需求量非常大（国家药典委员会，2015）。由于杭白芷生物学特性、栽培选育方式及适应气候和地理环境的差异，导致杭白芷种质混杂、药材质量下降。因此，研究杭白芷种质资源遗传多样性可为其品种选育的亲本选择及创制提供理论依据。[前人研究进展]目前，已有较多利用分子标记技术对白芷种质资源进行鉴定及遗传多样性和亲缘关系分析的相关研究报道。黄璐琦等（1999）对兴安白芷、祁白芷和杭白芷进行RAPD分析，结果表明，祁白芷和杭白芷属于同一类群，但二者是否由兴安白芷驯化而来，尚需与近缘物种雾灵当归及台湾当归进行深入比较研究。杨滨等（2004）对祁白芷和杭白芷主要产区的种植种类及其周边的野生近缘种进行RAPD及内转录间隔KITS1和ITS2序列分析，结果表明，祁白芷、禹白芷、川白芷和杭白芷4类栽培白芷均来源于台湾白芷。陈要臻等（2008）建立了白芷的AFLP最佳反应体系，并筛选出适宜引物，可用于白芷种质资源鉴定及其遗传多样性分析。郭丁丁等（2009）对不同产地的祁白芷、禹白芷、川白芷和杭白芷4类栽培白芷遗传多样性进行ISSR分析，并计算其基因遗传相似度，结果显示，4类栽培白芷问存在遗传分化，均单独聚成一支，表明各类栽培白芷的品种间亲缘关系较近，遗传多样性水平较低。沈晓霞等（2012）利用筛选的12对AFLP引物对来源于浙江磬安和东阳地区的50份杭白芷种质资源进行遗传多样性分析，结果显示50份杭白芷种质遗传相似度均在70%以上，表明其亲缘关系较近。近5年来未见有关白芷（或杭白芷）的种质资源遗传多样性和种群遗传结构等方面的研究报道。[本研究的切入点]与RAPD、AFLP、ISSR等分子标记相比，SSR标记具有高度的多态性，可全面反映核基因组的遗传信息，揭示居群间基因流、核基因分化程度及基因型纯合或杂合程度，目前已被广泛运用到物种遗传多样性、种群遗传结构和分子谱系地理学研究（Adams et a1.，2006；Correa et a1.，2017；董慧等，2017），但研究对象主要为草本植物、花卉、林木和作物等（Gustafsson，2000；Rajora et a1.，2000；Procacci-ni et a1.，2001；徐立安等，2001；高旭等，2016；Wanget a1.，2016；韩志校等，2017；张洪源等，2017），鲜见应用于药用植物杭白芷遗传多样性和遗传结构研究的文献报道。[拟解决的关键问题]从已发表的白芷同属植物当归（Angelica sinensis）sSR引物中筛选出多态性引物，并利用其对不同来源地的53份杭白芷种质材料进行PCR扩增，并分别采用Genepop 4.0、GenALEx 6.4.1和Structure 2.2进行遗传多样性、遗传差异及聚类分析，为白芷种质资源的可持续利用及新品种选育和创制等提供理论依据。

1材料与方法

1.1试验材料

于2015年1月-2016年9月从咸阳、昆明和南京采集53份杭白芷新鲜幼嫩叶片材料，根据来源地的不同进行编号和种群划分（表1），并用硅胶干燥保存，用于后续试验。50 bp DNA Ladder、PCR试剂和Taq聚合酶购自TaKaRa公司。主要仪器设备：Ther-mal Cycler2720 PCR扩增仪、多功能暗箱式紫外分析仪、台式高速离心机和超微量分光光度计（Nano-drop）。

1.2试验方法

1.2.1总DNA提取 采用改良后的CTAB方法（Doyle，1991）提取杭白芷新鲜幼嫩叶片总DNA，并用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。采用Nanodrop2000C超微量分光光度计测定DNA浓度。

1.2.2 SSR引物选择 从Lu等（2015）已发表的白芷同属植物当归（A.sinensis）18对SSR引物中筛选出针对杭白芷具有较高多态性的6对引物，并在其上游引物5端分别加JzFAM或TAM荧光标记（表2），由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成，用于后续杭白芷遗传多样性分析试验。

1.2.3PCR扩增 PCR反应体系20.0 μL：10×PCRBuffer（Mg²⁺Free）2.0 μL，DNA模板2.0 μL，2.5mmol/L each dNTP 1.0 μL，0.4 gmol/L正、反荧光引物各1.0 μL，2.5 mmol/L Mg²⁺1.0 μL，1 u Taq聚合酶0.2 μL，ddH202补足至20.0 μL。扩增程序：94℃預变性5 min；94℃30 s，50-55 ℃退火1 min，72℃ 45 s，共进行35个循环；72℃延伸8 min，4℃保存。PCR扩增在Thennal Cycler2720 PCR扩增仪上完成。取3.0 μL PCR产物，加入4μL 10×Loading Buffer，混匀后，用2%琼脂糖凝胶电泳检测（电压140 V，时间20-30 min），并在紫外分析仪下观察和拍照。PCR产物送至上海美吉生物医药科技有限公司进行STR分型分析，再由Genotyper 4.0获取基因型数据。

1.2.4遗传多样性分析 采用马尔可夫链方法，运用Genepop 4.0对杭白芷的SSR位点进行哈代温伯格（HW）平衡检验（参数设置：Dememorization为1000；批次为100；每批迭代为1000）（Raymond andRousset，1995），并对所得P进行Sequential Bonferro-ni校正。利用GenALEx 6.4.1计算等位基因数量（Na）、有效等位基因数量（Ne）、期望杂合度（He）和观测杂合度（Ho）（Peakall and Smouse，2006）。利用Arlequin 3.0计算基因流（Nm）、Shanon信息指数（I）和Wrights F-statistics近交系数（FIS），并用1000次置换进行显著性检验（Excoffier et a1.，2005）。

1.2.5聚类分析 基于SSR多态性分析结果，采用混合和相关等位基因模型，运用Structure 2.2对3个杭白芷种群进行聚类分析（Pritchard et a1.，2000）（参数设置：Burnin设为100000；MCMC重抽样设为100000；K（分组数）设为1、2和3，均重复10次）。最后根据概率对数值[Ln probabilit），of data，LnP（D）]选择最合适的分组数。同时利用MStool计算种质材料问共享等位基因的相似度，并根据相似度利用MEGA 5.1构建UPGMA聚类树状图。

1.3种群间遗传差异分析

利用Arlequin 3.0计算种群问的遗传分化指数（FST），并用10000次置换对其进行显著性检验（EX-coffier et a1.，2005），并用Sequential Bonferroni校正法对P进行校正。

2结果与分析

2.1杭白芷总DNA提取结果

采用改良的CTAB法提取杭白芷新鲜幼嫩叶片总DNA，琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，DNA条带稳定、清晰、单一（图1）。总DNA浓度为56-188ng/gL，OD260/OD2so为1.63-2.02，提取质量较高，可用于后续试验。

2.2杭白芷种质资源的遗传多样性分析结果

由表3可知，从6个SSR位点共检测到37.0个等位基因，平均每个位点6.2个，其中以C023位点的Na最多（13.0个），C022的Na最少（2.0个）；Ne为1.058-3.078个，平均1.798个，Na和Ne均较低表明杭白芷种质资源遗传多样性较低；伪1.688-1.996，平均1.802，表明6对SSR位点多样性信息量差异较小；Ho为0-0.512，平均0.245，He为0.049-0.663，平均0.304；Nm为0.168-5.732，平均1.340，表明3个种群间存在一定程度的基因交流。

由表4可知，各种群的Na为1.7-3.8个，平均2.9个等位基因；140均低于He，平均Ho为0.245，平均He为0.304，其中KZ种群的Ho和He最高，分别为0.481和0.508，表明KZ种群遗传多样性高于NZ种群和XY种群。6个SSR位点均极显著偏离哈代一温伯格平衡（P<0.0 1，下同），经过Sequential Bonferroni多重检验校正后仍达极显著水平。综上所述，杭白芷种质资源遗传多样性低，且近交程度较高，种质衰退严重。

2.3杭白芷种质资源的聚类分析结果

种群聚类分析结果（图2）显示，当K=2时具有最大的概率对数值，表明3个杭白芷种群最适合聚类分成两组，即XY种群和NZ种群聚为一组，KZ种群单独为一组，但KZ种群与NZ种群部分个体问存在基因流动，表明杭白芷种质资源的使用以本地为主，异地资源使用较少。从UPGMA聚类树状图（图3）也可看出，53份杭白芷种质材料间遗传距离均较近，可将其聚为两大类，KZ种群的大部分个体（如KZ19、KZ17、KZ16、KZ15、KZ12、KZ9、KZ11、KZ14、KZ44、KZ8和KZ10等）和NZ种群的部分个体（如NZ34、NZ45、NZ29、NZ43和NZ33等）聚为一类；NZ种群的其余个体与XY种群个体聚为一类，个体相互交叉，无明显界限，表明KZ种群与XY种群和NZ种群亲缘关系相对较远，而XY种群与NZ种群亲缘关系较近。该结果与种群聚类分析结果基本一致。

2.4杭白芷种群间遗传差异分析结果

由表5可知，XY种群与NZ种群问的FST（0.208）明显低于KZ种群与XY种群间的FST（0.506）及KZ种群与NZ种群问的FST（0.510）；XY种群与NZ种群问的遗传相似度较高，为0.899，KZ种群与NZ种群和XY种群的遗传相似度较低，分别为0.354和0.37 1，表明XY种群与NZ种群间遗传分化程度均较低，遗传差异较小；KZ种群与NZ种群和XY种群遗传分化程度均较高，遗传差异较大。证实了上述结论即3个种群间存在一定程度的基因交流（Nm=1.340），也与聚类分析结果相互印证。

3讨论

3.1SSR多态性引物选择

筛选适用引物是种质资源遗传多样性ssR分析的关键，但目前未见有杭白芷SSR引物的文献报道，仅Lu等（2015）报道了白芷同属植物当归（A.sinen-sis）的18对SSR引物。经本研究筛选，从中获得6对具有较高多态性的SSR引物，说明同属不同种的SSR引物具有一定通用性。该结论在榕属植物中也得到了证实，即Zheng等（2015）开发出16对粗叶榕的SSR引物，其中有11对引物可在同属其他29个物种中实现了多态性条带扩增。因此，通过从已发表的相关文献报道中筛选适用的SSR引物，可节省开发SSR引物所耗费的大量人力、物力和财力。

3.2杭白芷种质资源的遗传多样性

杭白芷原产地为浙江杭州，随后逐渐引入我国中部及西南地区，目前尚未发现其野生种群，且各地种植的杭白芷品种不纯，质量千差万别，不同产地问的种子交流使得其种质衰退，如抗病和抗虫能力下降、产量降低等（赵东岳等，2015），因此，亟需对杭白芷种质进行改良。物种的遗传多样性及资源评价是品种选育的基础工作。本研究采用SSR分子标记技术对杭白芷进行遗传多样性分析，对其品种选育具有重要意义。

本研究杭白芷种质资源遗传多样性分析结果显示，6对SSR引物可扩增出37.0个等位基因，每个位点可检测到2.0～13.0个，平均I为1.802；3个种群的平均Na较低，仅2.9个，3个种群的平均Ho为0.245，平均He为0.304，尤其XY种群和NZ种群的Ho和He均低于平均值，表明3个杭白芷种群遗传多样性较低。这可能与采集样本数量不足和同一种群样品采集区域范围较小有关（沈晓霞等，2012）。本研究还发现，3个杭白芷种群的平均FIS为0.270，表明杭白芷种质资源近交程度较高，其原因可能是杭白芷栽培时受人工选择的影响，间接导致严重的种质衰退问题。上述结果与前人研究结果基本一致，黄璐琦等（1999）研究发现，杭白芷种质资源呈低水平的遗传变异；沈晓霞等（2012）研究发现，50份杭白芷种质遗传相似度均超过70%，亲缘关系较近。可见，杭白芷种质资源的遗传多样性较低。

本研究聚类分析和种问遗传差异分析结果显示，KZ种群与XY种群和NZ种群间的遗传相似度均较低，分别为0.354和0.371，可能是由于種群采集地相距较远，气候、土壤等地理环境相差较大所致；XY种群和NZ种群的遗传相似度较高（0.899），与郭丁丁等（2009）研究结果基本一致，推测xY种群和Nz种群多数是从同一地区引种。

综上所述，杭白芷遗传多样性较低，出现了严重的种质衰退问题，后续研究应增加种群及其个体数量，并对杭白芷的栽培分布区进行取样，全面剖析其种群遗传结构，为杭白芷种质资源的选育及可持续利用提供参考依据。

4结论

同属不同种的SSR引物具有一定通用性。不同来源地的杭白芷种群间存在一定程度的遗传分化，但总体遗传多样性较低，应加大力度寻找其近缘野生资源，保障白芷种质资源的可持续利用。

（责任编辑 陈燕）