鱼类三代虫生物学和分类学研究进展

陈 涛

(1.陕西师范大学 生命科学学院，陕西 西安 710062； 2.桂林理工大学 教务处，广西 桂林 541004)

三代虫科属扁形动物门、单殖吸虫纲、多钩亚纲、三代虫目[1]，是一类常见的鱼类体外寄生虫，主要寄生在200种硬骨鱼[2]及少数软体类和两栖类的体表[3-4]。全世界记录的三代虫已超过450种，潜在总物种数可能超过20 000种[5-8]。三代虫科国内记录了3属60种[9-12]，其中三代虫属(Gyrodactylus)共58种、薄片吸虫属(Laminiscus)和拟三代虫属(Paragyrodactylus)各1种。三代虫的繁殖方式为独特的超胎生，即母体中已孕育子代，子代中又孕育第三代，甚至第四代，而其他单殖吸虫为卵生[13-14]。三代虫主要通过宿主间相互接触传播，短期内快速增殖，给宿主造成极大危害[15]。随着鱼类养殖密度不断增大，三代虫引起的疾病越来越严重，如G.salaris对挪威大西洋鲑(Salmosalar)的养殖造成了巨大的经济损失[16]，国内三代虫病的主要病原体是细鳞鱼三代虫(G.lenoki)、古雪夫三代虫(G.gussvi)和小林三代虫(G.kobayashii)等[17-19]。为了准确鉴定物种和防控三代虫病，已开展了形态、分类、繁殖、宿主免疫、种群动态、线粒体基因组、系统进化及谱系地理等研究[6,20-22]。目前，三代虫分类主要通过测量后吸器中央大钩、边缘小钩和联结片等骨化结构的形态特征，并结合分子标记鉴定[8,23]。笔者综述了三代虫的生物学特征、形态分类、分子标记及线粒体基因组等方面的研究现状及发展趋势，为生物学和分类学研究及病害防治提供基础资料。

1 三代虫的生物学特征

三代虫雌雄同体，体长约0.6 mm。虫体前端有一对头器和刺状感受器，无眼点；口位于头器下方中央；咽后为食道及交配囊；体中部两侧肠分支；体中后部为生殖系统，包括卵巢、睾丸和卵黄腺等；体后端的后吸器由一对中央大钩、背腹联结片各1片及8对边缘小钩组成。

三代虫通过后吸器的中央大钩和边缘小钩附着，以寄主的黏液和分泌物为食，头器的运动造成寄主损伤，进一步引起继发感染，导致鳃、鳍溃烂及其他疾病。如大西洋鲑致命性病原体G.salaris对挪威的养殖和野生鲑鱼种群造成极大危害，已被列为口岸检验物种[24]。G.salaris和G.turnbulli在实验室连续培养研究超过5年和10年，受到极大关注，被称为寄生虫界的“果蝇”[25-26]。国内各养殖区均发现作为病原体的三代虫，湖北和广东尤为严重[27]。

1.1 三代虫研究历史

1832年，von Nordmann首次发现寄生于欧鳊(Abramisbrama)的三代虫G.wangnei，误将子宫中胚胎的大钩理解为“胃钩”[28]，随后von Sieboldt第一次证实三代虫为胎生繁殖[29]。

有关三代虫早期的研究主要集中在染色体和胚胎细胞等方面[6]；后期逐渐成为鱼类病原体而受到关注[30-31]，其中G.salaris不同程度地感染了挪威37条河流中的大西洋鲑[32]。1970年，Malmberg记录的三代虫超过200种，主要分布于欧洲、亚洲和北美洲[33]，目前已记录的三代虫超过450种[5-9]。

1948年，我国首次在鲫鱼(Carassiusauratus)的体表发现了秀丽三代虫(G.elegans)[1]，开启了三代虫研究，之后陆续有学者进行三代虫分类研究，2012年贺怀亚等[10]整理三代虫物种名录，共52种，目前共记录60种[9-12]。

1.2 三代虫的性早熟和胎生

性早熟是三代虫的一种生殖适应，其中胎生三代虫高度性早熟[34]，三代虫属第一代出生仅需几天，而卵生的Oöegyrodactylusfarlowellae第一代出生则需几周。Cable等[14]描述三代虫雌性生殖系统早熟时，发现其他单殖吸虫包括卵生三代虫的雌性生殖系统包含大量的卵黄腺，而胎生三代虫仅存在一个简单的细胞体。胎生三代虫的雌性生殖系统早熟，而其他单殖吸虫则是雄性生殖系统早熟。胎生的Macrogyrodactylus属极少出现性早熟，需经历较长的胚后分化，特别是体后部的腺组织和表皮细胞[35]，而Isancistrum属的性早熟缩短生命周期，导致后吸器缺失中央大钩和联结片，其他系统也简化。胎生作为另外一种重要生殖适应，可减少世代获得时间，最终损失卵壳。

1.3 三代虫的表皮和附着器

具有表皮合胞体的三代虫物种包括G.gasterostei、G.eucaliae、G.turnbulli和G.bullatarudis等[35-36]。胎生种类的表皮有细胞核，而其他单殖吸虫表皮无细胞核。G.eucaliae表皮细胞产生两种不同的分泌囊泡[36]，而Macrogyrodactylusclarii产生3种囊泡[37]。三代虫外胞质层缺少细胞核、线粒体、高尔基体，而内质网仅出现在皮下细胞。

胎生三代虫主要通过后吸器的边缘小钩附着，而中央大钩和腹联结片则作为分类结构。寄主体表肌肉组织舒张时，三代虫中央大钩转动并移动腹联结片起到压力板作用，防止后吸器和中央大钩滑落[38]。较大的卵生三代虫O.farlowellae需更强的附着力，防止从寄主体表滑落，因此以中央大钩附着为主，而边缘小钩仅起辅助附着的作用[34]。G.poeciliae边缘小钩钩尖长度小于1 μm，容易从寄主体表滑落，而G.milleri牢固的边缘小钩可长期附着在相同寄主体表[39]，因此三代虫属物种倾向于通过边缘小钩附着，中央大钩用作压力板，Isancistrum属和Anacanthocotyle属三代虫缺少中央大钩和联结片，仅以边缘小钩附着[3,40]，而体更长的Macrogyrodactylus、Swingleu、Polyclithrum、Mormyrogyrodactylus属三代虫则以后吸器附着[41]。寄生于爪蟾蜍(Xenopuslaevis)的三代虫G.gallieni也以后吸器附着。

1.4 三代虫体内主要系统

消化系统：三代虫主要以寄主的表皮细胞和黏液为食，肠两侧分支末端封闭，除Isancistrum属外均具有合胞体[34,42]，而Isancistrum属肠分支末端融合成环状。三代虫肠表皮无细胞核，而许多细胞质内含不同的消化囊泡[43]。G.salaris直接以寄主表皮细胞为食，G.gasterostei每15～30 min进食一次，可吞食一块含30个细胞的表皮[6]。

腺系统：Wagener[44]首次描述三代虫的腺体及分布，随后Kritsky[45]将三代虫G.eucaliae中的腺体分为3种类型：3对背部两侧对称腺体群产生的酸性分泌物、1组咽之后的后腹部腺体分泌的颗粒酸性分泌物及1对前腹部腺体群产生碱性分泌物, 而头腺主要起黏附作用。

排泄系统：包括2个纵向环状通道和来自单个焰细胞的接收小导管，焰细胞和导管结构与其他扁形动物的相似[14]。

神经系统：早期使用硫代胆碱法描述三刺鱼(Gasterosteusaculeatus)的未命名三代虫的神经系统[46]，随后通过免疫细胞化学揭示G.salaris存在正交神经索特征[47]，而共聚焦扫描电镜揭示M.clarii的肌肉空间排列和相关胆碱、肽和胺类神经分布[48]。

生殖系统：三代虫的雄性生殖系统由睾丸和雄性生殖器组成。球形的雄性生殖器由前列腺和射精管组成交配囊，内含大刺和小刺。卵生Ooegyrodactylus属和非洲胎生三代虫属具有管状雄性生殖器[49]；Mormyrogyrodactylus属具有触须形管状结构[41]，可延伸到体外，功能类似雄性外生殖器；Nothogyrodactylus、Aglaiogyrodactylus、Onychogyrodactylus属的雄性生殖器周围包括辅助的骨片。卵生属具有2个形状不同的精囊[50]，而胎生属的精囊仅1个。卵生的O.farlowellae雌性生殖系统包括位于睾丸之后的1个卵巢，通过雌性输卵管向体外侧开口，开口作为成体的阴道，受精即雄性生殖器插入阴道[34]，卵黄腺未完全发育。胎生三代虫最明显的是子宫，卵巢则简化为精巢的后壁，缺乏独立连接的雌性或雄性生殖系统通道。

三代虫的子代突破体壁[35]，之后体壁愈合，留下永久的雌性开口。G.turnbulli直接将雄性生殖器插入同种三代虫体内，开始交配，雄性生殖器抓紧对方后相互受精[51]，而卵生三代虫的受精则是雄性生殖器直接插入对方的子宫孔[35]。

2 三代虫形态分类

三代虫的形态分类主要依据后吸器中央大钩和背腹联结片，其中腹联结片在识别新种上起决定作用。影响中央大钩和联结片发育的因素包括季节、寄主和附着位点[52]，其中低温能延长胚胎发育时间，是导致三代虫中央大钩变大的一个因素。

1946年Sproston仅通过边缘小钩识别秀丽三代虫或中型三代虫(G.medius)，但该方法不可靠，产生了许多错误记录[53]。直至1970年Malmberg[33]首次基于排泄系统并补充边缘小钩作为鉴定依据，正式提出三代虫属的分类系统，将其分为六个亚属：三代虫亚属(Gyrodactylus)、Mesonephrotus、Paranephrotus、Metanephrotus、Neonephrotus和Limnonephrotus，但该分类系统基于寄主和寄生虫的协同进化，缺点是缺乏单独特征来确定排泄系统的进化方向，物种分布仅限于欧洲斯堪的纳维亚半岛，且只能研究活体，而许多北美洲和亚洲物种可能属于已存在的种群，但未被完整描述而难以证实。

2.1 三代虫科的分类

三代虫科最初仅包括胎生的三代虫属，之后Fuhrmann[54]发现，Isancistrinae亚科Isancistrum属缺少中央大钩和联结片，Polyclithrinae亚科Polyclithrum属的后吸器出现较多的联结片，其他属统称为三代虫亚科，但这些亚科主要基于形态分类，可能并未真实反映物种关系。根据生殖方式的不同，三代虫科分为卵生和胎生两科，后期研究发现，独立的卵生科Ooegyrodactylidae为并系群[34]，因此卵生科应属于三代虫科[6]。目前三代虫科包括4个亚科：Isancistrinae、Gyrdactylinae、Macrogyrodactylnae和三代虫亚科[1]。

2.2 三代虫属的分类

根据形态分类标准及繁殖方式差异，三代虫科分为30个属[6]，包括7个卵生属(Aglaiogyrodactylus、Hyperopletes、Ooegyrodactylus、Phanerothecium、Phanerothecioides、Nothogyrodactylus和Onychogyrodactylus)和23个胎生属(Afrogyrodactylus、Accessorius、Acanthoplacatus、Anacanthocotyle、Archigyrodactylus、Fundulotrema、Gyrdicotylus、Gyrodactyloides、三代虫属、Isancistrum、Macrogyrodactylus、Mormyrogyrodactylus、Neogyrodactylus、Neogyrodactylus、Metagyrodactylus、Polyclithrum、Micropolyclithrum、Scleroductus、Swingleus、拟三代虫属、Paragyrodactylus、Paragyrodactyloides和薄片吸虫属)，其中胎生属中的7个属由于重名或同物异名，属于无效命名，分别为：Paragyrodactyloides、Neogyrodactylus、Neogyrodactylus、Micropolyclithrum、Fundulotrema、Metagyrodactylus和Afrogyrodactylus[6,55-56]。因此三代虫科有效属为23个，包括7个卵生属和16个胎生属，其中卵生属三代虫仅感染南美的条纹鸭嘴鲇(Pseudoplatystomafasciatum)和蜥形克隆甲鲇(Kronichthyslacerta)，国内三代虫科仅包括三代虫属、薄片吸虫属和拟三代虫属[9-10]。胎生属中体长最短的Isancistrum属约0.1 mm、三代虫属约0.6 mm、最长的Macrogyrodactylus属约1.5 mm。拟三代虫属和三代虫属的主要区别在于中央大钩基部具有类似头盔状的骨片[9]。

3 三代虫的分子标记

1991年Wilson[57]用分子标记研究三代虫分类学和系统学，随着致病性的G.salaris威胁扩大，传统的形态学分类方法难以鉴定该物种，随后使用分子标记鉴定致病和其他非致病性的G.salaris[58]。津巴布韦、南非、墨西哥和中国等国家的学者也使用分子标记研究本地三代虫，发现了许多新种[8-9,59]。

3.1 核内分子标记

首个分子标记是核内核糖体18S rDNA的V4可变区，用于鉴别致病性的G.salaris和非致病性的G.truttae及G.derjavini，但难以区分G.thymalli和G.teuchis。随后提出测定内转录间隔区和核糖体5.8S rDNA，其中序列高度保守的5.8S rDNA成为属内鉴定的合适标记[60]。也有研究使用内转录间隔区构建三代虫属系统进化关系[61]，同时通过内转录间隔区的属级系统进化关系可用于评价亚属和种群的有效性[60]，内转录间隔区序列还可用于验证基于排泄系统和边缘小钩确立的三代虫亚属分类系统，支持三代虫亚属、Neonephrotus和Limnonephrotus亚属为单系群，未支持其他3个亚属作为单系群[6]。内转录间隔区比28S变异大，优于V4可变区，已使用内转录间隔区测定128个种，比较适合欧亚淡水鱼类的G.wageneri种团[6,8-9]。

核内分子标记也存在一些不足：内转录间隔区序列变异大，存在插入或缺失，不适合属级系统进化分析，适合复杂的种内鉴定；5.8S rDNA更适合属级比较，但序列太短；18S rDNA的V4可变区包含充足的变异，但序列也较短；序列较长的18S和28S更适合科级水平系统进化；核糖体基因间隔区仍存在协同进化的制约，也未能成为单独的分子标记。

3.2 线粒体基因分子标记

用线粒体基因标记分析三代虫G.salaris进化的是COⅠ基因[62]，与核糖体基因标记相比，COⅠ基因突变率高，进化速率更快，可用于检测内转录间隔区数据的有效性，也是重建三代虫物种形成不可或缺的分子标记，但受线粒体基因核复制数和假基因影响，仍需更多的分子标记构建系统进化分析和物种鉴定。目前还使用线粒体NA5和COⅡ基因研究三代虫分类及谱系地理[22，63]。

4 三代虫线粒体基因组

目前已测定9种三代虫的全线粒体基因组，包括卵生Aglaiogyrodactylus属1种，胎生的三代虫属7种和拟三代虫属1种，分别为G.thymalli、G.salaris、G.derjavinoides、G.kobayashii、G.brachymystacis、G.parvae、G.gurleyi、Paragyrodactylusvariegatus和Aglaiogyrodactylusforficulatus[64-65]。线粒体基因组长度为14 371～14 790 bp，均包含12个蛋白编码基因、22个转运RNA基因、2个核糖体RNA基因及1～2个不等的非编码区。最短的卵生属A.forficulatus为14 371 bp，2个非编码区序列长度分别为485 bp和733 bp，A+T的总含量为75.12%；中等长度的胎生拟三代虫属P.variegatus为14 517 bp，1个主要的非编码区序列长度为1093 bp，A+T的总含量为76.3%，最长的为胎生三代虫属G.salaris为14 790 bp，2个非编码区序列长度分别为799 bp和768 bp，A+T的总含量为65%，明显低于A.forficulatus和P.variegatus。卵生属A.forficulatus线粒体基因组长度最短，其次为胎生拟三代虫属P.variegatus，最长的为胎生三代虫属G.salaris。系统进化分析表明，卵生属A.forficulatus位于三代虫科最基部，之后为拟三代虫属P.variegatus，最后为三代虫属物种[65]。

5 形态结合分子分类

目前三代虫的分类主要根据后吸器中央大钩和联结片的形态特征及测量数据并结合分子标记，主要用于鉴定新种和对已知种的分子确认及研究基因流、遗传漂变、种群分化，探讨形态特征是否真实反映物种进化，还是属内或种内多样性及环境影响[59, 66-67]。其中基于内转录间隔区rDNA序列推断三代虫属4个亚属的系统进化表明，每个三代虫属亚属都有唯一的5.8S基因序列，同时种的水平上表现在后吸器形态和尺寸差异很低，但内转录间隔区的分子差异却很高，因此可用内转录间隔区鉴定物种[68]。此外，通过测量后吸器中央大钩及边缘小钩的主要参数并结合分子标记研究津巴布韦、南非、墨西哥、保加利亚、中国等国家本地三代虫，发现了许多新种[8-9，11-12，59，66-69]。因此，通过形态学测量后吸器的骨化结构的形态特征并结合分子标记仍然是未来鉴定三代虫新种的主要方法。

6 展 望

三代虫研究已取得的进展包括建立属级和科级分类系统、鉴定许多新种及开展相关谱系地理研究，但这对于潜在超过20 000种的三代虫分类和疾病防治还存在很大差距，特别是国内许多省区三代虫研究还存在空白。今后应加强形态学结合分子数据联合的生物学和分类学研究，寻找更多特异性分子标记，对其分布、传播、繁殖以及室内培养等进行深入研究、并逐步完善国内分类系统，为三代虫的生物学、分类学、新种鉴定及病害防治提供科学依据和理论指导。