孕酮对奶牛子宫内膜上皮细胞信号通路的影响

黄霞，林家琪，李建基，王亨，崔璐莹

（扬州大学兽医学院，江苏 扬州 225009）

孕酮作为一种类固醇激素，对雌性动物的生殖活动起着重要的调控作用[1]。目前大量研究发现，产后子宫内膜炎的发生与奶牛体内的孕酮水平有密切联系[2]。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路在炎症反应中具有重要作用，孕酮对奶牛子宫内膜细胞MAPK信号通路的影响目前尚无报道。故本试验开展了孕酮对奶牛子宫内膜上皮细胞MAPK信号通路的影响研究，通过采用与奶牛产后相似浓度的孕酮处理原代培养的奶牛子宫内膜上皮细胞，来检测MAPK信号通路（ERK、JNK和P38）的磷酸化情况。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 奶牛子宫角 奶牛子宫取自扬州屠宰场，无菌采集未孕健康奶牛的子宫，尽快送往实验室。

1.1.2 主要试剂与仪器 试剂：DMEM/F12培养基、孕酮（Sigma，美国）；无内毒素胎牛血清（四季青，中国）；蛋白酶抑制剂、RIPA裂解液（北京普利莱基因技术有限公司）；兔抗鼠Phospho-p38 MAPK，Phospho-p44/p42 MAPK（ERK1/2），Phospho-SAPK/JNK，β-actin一抗和山羊抗兔二抗（CST，美国）。仪器：PVDF膜（Millipore，德国）；二氧化碳培养箱（Thermo，美国）；超纯水系统（Millipore，美国）；紫外分光光度计（Thermo公司，美国）；蛋白电泳系统（BIO-RAD公司，美国）等。

1.2 方法

1.2.1 原代细胞培养和细胞传代 无菌采集子宫，带回实验室。在超净工作台内切下子宫角，用预冷的含有5%双抗的PBS反复冲洗3次，至液体澄清，于4℃静置30min，然后将子宫角纵向剖开，修剪为约3×3 cm2的小块，放入50 mL无菌离心管中，加入0.1%链蛋白酶，至完全浸没子宫角组织，于4℃消化16～20h。取出子宫角，用灭菌手术刀轻轻刮取子宫角内膜，放置于PBS中重悬，1200r/min离心5min，弃去上清液，再加PBS重悬，离心，重复3次。然后加入DMEM/F12完全培养基，吹打成细胞悬液，在37℃、5%CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养，每天换一次细胞培养液，3～4d即可获得原代细胞。采用胰蛋白酶消化法进行上皮细胞传代培养，于37℃、5%CO2饱和湿度下培养，每天换一次细胞培养液，约3 d即可获得传代培养细胞[3]。

1.2.2 CCK-8法检测不同浓度孕酮对奶牛子宫内膜上皮细胞活性的影响 将细胞按103cells/孔浓度接种到96孔细胞板内，待细胞 80%以上汇合后更换含不同浓度（0、1、3、5、10、20ng/mL）孕酮的培养基继续培养24h；用PBS洗涤，每孔3次；再向每孔加入10μL CCK-8和100μL基础培养基预混液，继续放入培养箱内孵育4h，在波长490nm处检测吸光度。每个时间点分组设置6个重复，以时间为横坐标、细胞存活率为纵坐标绘制曲线。

1.2.3 Western blot法检测MAPK信号通路关键蛋白的表达量 将细胞按106cells/孔浓度接种到六孔细胞板内，待80%以上细胞汇合后用PBS清洗，更换含不同浓度孕酮（0、1、3、5ng/mL）的基础培养基继续培养30min，收集细胞。将细胞经胰酶消化处理后，加入适量的细胞裂解液提取总蛋白，用BCA法测定蛋白质浓度。每组统一上样20μg/孔，将分装好的蛋白样本进行SDS-PAGE凝胶电泳1.5h。采用半干法将所需蛋白转移至PVDF膜上，用5%脱脂乳封闭1h。使用1∶1000稀释的β-actin一抗孵育PVDF膜，4℃过夜。清洗后，将PVDF膜转移到含有兔抗鼠HRP偶联IgG二抗的封闭液中（1∶10000稀释），室温孵育1h。使用DAB显色试剂盒显影，并用化学发光成像系统采集图像，根据得到的图像数据对试验结果进行分析。

1.2.4 数据处理 试验数据采用SPSS 18.0软件中的One-way ANOVA和Duncan法进行统计分析，结果以M±S表示。P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

2 结果分析

2.1 不同浓度孕酮对奶牛子宫内膜上皮细胞活性的影响 子宫内膜上皮细胞经不同浓度（0、1、3、5、10、20ng/mL）孕酮处理24h后，用CCK-8法检测此时子宫内膜上皮细胞的活性，结果如图1所示。与空白对照组相比，1、3、5、10、20ng/mL 浓度的孕酮未对细胞活性产生影响，且20ng/mL浓度范围内的孕酮对奶牛子宫内膜上皮细胞无毒性作用。

图1 孕酮对奶牛子宫内膜上皮细胞活性的影响

2.2 不同浓度孕酮对奶牛子宫内膜上皮细胞MAPK信号通路的影响 奶牛子宫内膜上皮细胞经不同浓度（0、1、3、5 ng/mL）孕酮处理 30 min 后，用Western blot法检测ERK、JNK、P38和p-ERK、p-JNK、p-P38蛋白的表达水平，结果如图2所示。与空白对照组相比，孕酮并未对子宫内膜上皮细胞ERK、JNK和P38的磷酸化产生显著作用，且不同浓度孕酮之间也没有显著差异。

图2 不同浓度孕酮对奶牛子宫内膜上皮细胞 MAPK蛋白表达的影响

3 讨论

孕酮是一种重要的生殖激素，对维持妊娠有重要作用。研究发现，在母牛发情周期中，卵泡期的血浆孕酮一直处于一个较低水平；排卵后，由于颗粒细胞在卵泡刺激素作用下黄体化，孕酮分泌增加[4]。在母牛的发情周期中，发情当天孕酮含量最低，为0.37±0.97 ng/mL，一直持续到发情后第3 d（均低于1ng/mL），从第4d起孕酮水平升高至1ng/mL以上，到第15d时达到最高值3.9±2.22ng/mL[5]。由于产后孕酮水平会出现急剧下降[6]，所以，我们选择了与发情周期相似的孕酮浓度来作用于子宫上皮细胞，以更好地模拟体内环境。

研究发现，孕酮的许多功能都是通过与作为配体转录因子的孕酮受体（PGR）结合来介导的[1]。最近发现的PGR激活转录的机制是通过激活Src/Ras/Raf丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号级联能力来实现的。这表明PGR不仅能够作为转录因子起作用，而且可以直接激活细胞质中的信号传导途径[7]。本试验探究的MAPK信号通路是哺乳动物细胞中关键的信号转导系统之一，参与介导生长、发育、分裂、分化、死亡以及细胞间的功能同步等多种细胞过程[8]。其中，ERK、JNK和P38信号通路经炎症因子刺激活化后，对炎症起着重要的调控作用。国外学者发现孕酮可通过抑制MAPK活化，下调对LPS诱导的小胶质细胞TNF-α、iNOS和COX-2的表达，且该下调作用具有剂量依赖性[9]。这些都提示孕酮有着很好的抗炎效应。孕酮对奶牛子宫内膜上皮细胞MAPK信号通路的直接作用尚无报道，故我们选择与奶牛体内环境相似浓度的孕酮直接作用于经体外纯化培养的子宫内膜上皮细胞，通过细胞活性试验和Western blot法来进行检测。结果表明，经孕酮处理的子宫内膜上皮细胞活性并未因浓度的升高而产生较大变化；经不同浓度孕酮处理30 min后，MAPK信号通路中的ERK、JNK、P38的磷酸化情况也基本没有明显差异。由此我们得出结论，外源性的孕酮对奶牛子宫内膜上皮细胞的MAPK信号通路没有显著影响，不能通过孕酮来直接抑制MAPK的活化起抗炎效应。这个结果与Saut JPE得出的“卵巢类固醇对牛子宫内膜固有免疫相关的炎症反应影响不大”的结论相一致[10]，具有可靠性。