斑蝥酸钠对膀胱癌患者树突状细胞及BIU-87细胞的影响

宁 波，李朵璐，阚全程

(郑州大学第一附属医院肿瘤科 450000)

膀胱瘤是最常见的恶性肿瘤之一，它具有发病率高、复发率高、恶性程度低等特点[1]。膀胱癌患者的主要症状为血尿，临床上常采用造影和膀胱镜检作为膀胱肿瘤的诊断方法。膀胱癌可分为表浅性和浸润性两类，表浅性膀胱癌具有复发率高，转移率低的特点。浸润性膀胱癌具有浸润性和转移率高等特点[2]。树突状细胞(DC)是一种抗原递呈细胞，具有摄取、加工及递呈抗原，刺激T细胞活化和增殖，启动机体特异性免疫应答等功能，因此在肿瘤免疫过程中发挥关键作用[3]。有研究发现，如果DC数量减少或者功能缺失，使得DC不能刺激淋巴细胞增殖及免疫应答，最终导致机体免疫耐受，从而使肿瘤细胞逃脱机体免疫系统，在肿瘤的发生、发展和转移过程中起重要作用[4]。研究证实DC与膀胱癌有十分紧密的关系，与膀胱癌的分级和患者预后有紧密联系[4-5]。

DC在发育过程中能表达一系列分化抗原，其中最直接与其功能有关的是CD1a，CD1a主要表达于人胸腺细胞，是鉴定人外周血与骨髓中DC的最好标记[6]。CD83是DC成熟的标志，在DC发育成熟的早期不表达CD83，当成熟时才表达CD83。由于肿瘤细胞CD83的低水平表达，不能使肿瘤抗原引起有效的免疫应答，从而诱导了T细胞的无能状态，使得机体的免疫系统不能将肿瘤细胞清除，是肿瘤无限制性生长的主要原因之一[7]。膀胱癌细胞BIU-87来源于人膀胱乳头状移行上皮癌，通常采用5×108细胞0.2 mL接种裸鼠皮下，肿瘤呈进行性生长，肿瘤结节病理检查与原标本癌组织相似，是临床实验室常用的实验用途膀胱癌细胞系。

斑蝥酸钠是斑蝥素的一种衍生物，目前临床上用于治疗肝癌和胃癌，与先导化合物斑蝥素比较，斑蝥酸钠具有毒性低和刺激性小等特点[8-11]。斑蝥酸钠抗肿瘤机制复杂多样，它能通过多种途径抑制肿瘤细胞，其中包括阻断细胞周期、诱导细胞产生凋亡、抑制肿瘤细胞侵袭和转移、提高患者机体免疫力等[12-14]。

在本实验中，一方面研究斑蝥酸钠对膀胱癌患者外周血来源的DC的成熟及功能的影响，另一方面研究斑蝥酸钠对膀胱癌细胞BIU-87增殖和凋亡的影响，进而从改变患者机体免疫力和抑制膀胱肿瘤细胞来综合探讨斑蝥酸钠的作用，为斑蝥酸钠临床应用于膀胱癌患者提供研究基础。

1 材料与方法

1.1材料 重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rh-GM-CSF)和重组人白细胞介素-4(rh-IL-4)(R&D Systems，USA)；FITC标记的抗人CD1a和CD83(USA)；Caspase-3、PARP、GAPDH一抗、HRP标记二抗(武汉三鹰生物技术有限公司)；Ficoll paque plus淋巴细胞分离液(GE Amersham Biosciences，USA)；RPMI-1640培养基、胎牛血清(HyClone Laboratories，USA)；BCA蛋白浓度测定试剂盒和AimexinV-FITC凋亡检测试盒(碧云天生物技术研究所)。

1.2DC体外培养及给药方法 选取15例膀胱癌患者及10例健康成人，每人抽取静脉血20 mL，采用Ficoll Paque Plus淋巴细胞分离液分离外周血单核细胞，在37 ℃，5% CO2的条件下培养2 h后，洗涤除去悬浮细胞，得到贴壁细胞。然后用含GM-CSF(1 000 IU/mL)、IL-4(500 IU / mL)和10%自体血清的RPMI-1640培养基培养，每24 h半量换液。在第5天将培养的细胞进行分组试验，分成以下组别：对照组(Control)、斑蝥酸钠低剂量组(0.01 μg/mL)、斑蝥酸钠中剂量组(0.05 μg/mL)、斑蝥酸钠高剂量组(0.25 μg/mL)、健康人组，第8天收集细胞行相关检测。

1.3流式细胞仪检测DC表面CD1a和CD83的变化 分别收集第8天的细胞，然后加入CD1a和CD83荧光抗体，室温、暗室避光孵育30 min，然后再加入2 mL预冷磷酸缓冲液，最后用流式细胞仪检测各组DC表面CD1a和CD83的表达情况。

1.4MTT法检测斑蝥酸钠对DC刺激淋巴细胞增殖的影响 取健康体检人静脉血，分离出单核细胞，在37℃，5% CO2的条件下培养细胞，2 h后吸取未贴壁的细胞，得到的即为淋巴细胞。收集培养第8天的各组DC并用丝裂霉素C(50 g/mL)孵育30 min，调整细胞密度为1×107/L，按照DC与淋巴细胞比例为1∶10混合，将混合细胞集中于96孔板，每组设6个复孔，连续培养48 h后，采用MTT法检测细胞活力，在570 nm处检测各孔吸光度值，按照公式计算淋巴细胞刺激指数。刺激指数=试验组OD值/对照组OD值。

1.5MTT法检测斑蝥酸钠对膀胱癌BIU-87细胞的抑制作用 BIU-87细胞用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养液培养，培养条件为37 ℃、5%CO2。实验分为对照组(不加药物)、10 μg/mL斑蝥酸钠组、20 μg/mL斑蝥酸钠组，每组设6个复孔，分别培养12、24、36和48 h后，加入MTT工作液，继续孵育4 h后，加入100 μL DMSO，酶标仪检测570 nm的吸光度值，计算细胞存活率。

1.6Annexin V-FITC/PI双染法检测斑蝥酸钠对膀胱癌BIU-87细胞凋亡的影响 按照1.5的分组方法，取对数生长期的BIU-87细胞分别接种于6孔板中，给药作用24 h后，消化、离心收集细胞，然后加入0.3 mL的结合缓冲液，混匀，每个测试样品加入5 μL Annexin V和5 μL PI，在室温孵育15 min后，补加0.2 mL结合缓冲液，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.7Western blot法检测Caspase-3和PARP的表达的变化 按照1.5方法处理细胞后，细胞用胰酶消化，收集细胞，用细胞裂解液破碎细胞，低温离心5 min，收集上清液即为提取蛋白。用BCA法进行蛋白浓度测定，采用SDS-PAGE法进行电泳，湿法转膜，脱脂奶粉封闭，分别加入Caspase-3、PARP和GAPDH一抗，4 ℃孵育过夜，滴加HRP标记的二抗，室温孵育2 h后，暗室滴加ECL发光液，扫描纪录。

A：对照组；B：低剂量组；C：中剂量组；D：高剂量组；E：健康人组

图1 DC形态(×400)

2 结 果

2.1流式细胞仪检测DC、CD1a和CD83的变化 倒置显微镜拍照结果见图1，与对照组相比，斑蝥酸钠处理组细胞体积变大，细胞变长，斑蝥酸钠高剂量组(图1D)细胞出现突起，形如树枝，和健康人组(图1E)的细胞形态类似。流式细胞仪检测结果如图2所示，与对照组相比，CD83与CD1a在斑蝥酸钠处理组中显著升高(P<0.05)。另外CD83与CD1a在斑蝥酸钠高剂量组中表达最高，且与健康人组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。

*：P<0.05，**：P<0.01，与对照组比较；#：P<0.05，##：P<0.01，与健康人组比较

图2 CD1a和CD83在DC中的表达

2.2斑蝥酸钠刺激异体淋巴细胞增殖能力的检测 与对照组相比，斑蝥酸钠处理组刺激淋巴细胞增殖指数显著高于对照组(P<0.05)。另外在斑蝥酸钠各剂量组中，高剂量组刺激淋巴细胞增殖指数最高，且与健康人组相比，差异无统计学意义(P>0.05)，见图3。

*：P<0.05，**：P<0.01，与对照组比较；#：P<0.05，##：P<0.01，与健康人组比较

图3斑蝥酸钠刺激异体淋巴细胞增殖指数

2.3MTT法检测斑蝥酸钠对膀胱癌BIU-87细胞的抑制作用 与对照组相比，各给药组中细胞存活率均有不同程度的降低，药物的抑制作用随斑蝥酸钠浓度和时间的增加而增大，同一时间点不同处理组之间相比，细胞存活率差异有统计学意义(P<0.01)，见图4。

**：P<0.01，与对照组比较

图4 MTT法检测不同浓度斑蝥酸钠处理后细胞的存活率

2.4Annexin V-FITC/PI双染法检测斑蝥酸钠对膀胱癌BIU-87细胞凋亡的影响 斑蝥酸钠组与对照组相比，细胞凋亡率显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)，见图5。

**：P<0.01，与对照组比较

图5流式细胞术检测不同处理组细胞凋亡状况

2.5Western blot法检测caspase-3和PARP蛋白表达的变化 与对照组相比，斑蝥酸钠组BIU-87细胞中Caspase-3和PARP蛋白表达显著增强(P<0.01)，见图6。

**：P<0.01，与对照组比较

图6 Western blot法检测Caspase-3和PARP蛋白的表达

3 讨 论

膀胱癌是最常见恶性肿瘤之一，临床上主要采用保留膀胱的手术治疗。这种治疗方法会使肿瘤切除不彻底，导致一半左右的患者2年内肿瘤的复发率非常高。目前，为了解决这一弊端，临床上在患者进行手术后，进行膀胱内灌注药物治疗，但是膀胱癌肿瘤常常发生耐药现象。斑蝥酸钠作为从天然化合物优化而来的化合物，不仅具有抗肿瘤活性，而且还能够调节机体的免疫功能。斑蝥酸钠具有相对分子质量小，容易进入细胞内的特点，另外还能提高患者免疫力。目前，临床上采用斑蝥酸钠与其他抗肿瘤药物联合，主要应用于肺癌、胃癌和老年膀胱癌等肿瘤的治疗[15-17]。斑蝥酸钠能够提高机体免疫功能，通过增加白细胞的数量，使得细胞因子分泌增多，提高免疫反应的速度和强度[18-19]。

DC能够摄取抗原，然后将抗原进行处理成具有免疫原性的多肽，在细胞表面表达MHC-抗原肽复合物，另外DC膜表面的特异分子能与淋巴细胞表面相应的配体结合，使抗原特异性T细胞得到激活和增殖，最终激活机体产生免疫应答[20-22]。DC广泛分布于体内各个部分，但是整体细胞数量少，不能满足实验研究和临床应用的要求，所以已经开发出多种途径产生大量DC，来源主要包括骨髓、脐血、外周血，其中最常用的途径为采集机体外周血，诱导成为DC[23]。

本实验从患者外周静脉血中梯度离心得到分离PBMC细胞，然后进行纯化，剩余的贴壁细胞即为单核细胞，利用GM-CSF和IL-4诱导单核细胞转化成DC。采用显微镜观察细胞形态变化，然后用流式细胞仪检测了DC表面的CD1a和CD80的表达情况。CD1a作为DC的特异性标志，CD1a表达量能够显示DC的数量，另外CD83分子是DC的成熟的标志[24-25]。

研究结果证明，斑蝥酸钠与DC共孵育后，培养细胞表面产生突起，形如树枝，同时DC表面CD1a和CD80的表达显著升高，斑蝥酸钠高剂量组与健康人组DC比较，差异无统计学意义。另外采用MTT方法检测了斑蝥酸钠对DC刺激淋巴细胞增殖能力，结果发现斑蝥酸钠能够增强淋巴细胞增殖能力。表明斑蝥酸钠能够增强膀胱癌患者DC的形成和CD1a与CD80分子的表达，进而提高患者的免疫能力。

细胞内环境的变化导致细胞应激反应的产生，进而会导致细胞发生自毁性死亡，即细胞凋亡。多种基因参与细胞的凋亡的整个过程，其中Caspase-3在此过程中发挥关键作用，当Caspase-3被激活后，细胞将会进入不可逆的凋亡进程，而且多种因素诱导的凋亡很大一部分都通过Caspase-3这一信号途径实现。PARP是一种DNA修复酶，定位于细胞核内，当细胞通过Caspase-3导致凋亡产生时，活化的PARP Caspase-3能够剪切激活PARP，进而导致细胞发生凋亡。

本实验通过MTT法证明斑蝥酸钠能够显著抑制膀胱癌BIU-87细胞的生长，且呈剂量和时间依赖性。通过Annexin V-FITC/PI双染法证明斑蝥酸钠能够诱导膀胱癌BIU-87细胞发生凋亡。另外进一步研究了斑蝥酸钠对凋亡蛋白Caspase-3和PARP表达的影响，结果发现，与对照组相比，斑蝥酸钠组BIU-87细胞中Caspase-3和PARP蛋白表达升高，促进BIU-87细胞发生凋亡。

综上所述，斑蝥酸钠一方面能够促进膀胱癌患者DC的成熟和增加DC刺激淋巴细胞的增殖能力，另一方面能够抑制膀胱癌BIU-87细胞的增殖，并促进其发生凋亡。本研究为斑蝥酸钠治疗膀胱癌的临床应用提供了一种新的策略，即膀胱灌注高剂量斑蝥酸钠杀灭肿瘤细胞，然后体内给予低剂量斑蝥酸钠激活机体免疫系统。