基于主成分分析和聚类分析研究贵州不同产地粗毛淫羊藿指纹图谱

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(贵阳中医学院， 贵州 贵阳 550002)

表1 样品产地信息

样品号产地详情 样品号产地详情 S1贵阳市乌当区水田镇S18毕节市织金县马场乡狮子山S2龙里县湾寨乡姨妈寨S19毕节市黔西县新坪村S3贵阳市花溪区燕楼乡S20大方县大海坝森林公园S4贵阳市乌当区永乐乡羊角村S21毕节市七星关区大石关S5长顺县营盘镇S22贵阳市南明区冒沙井苦月节山S6石阡县本庄镇乔牌村S23松桃县婆洞村S7石阡县聚凤乡指甲平村S24印江县峨岭镇普同村S8贵阳市乌当新场镇大桥村五保塘S25江口县唐古坡(省道旁)S9贵阳市修文县六屯镇独山村S26凯里市金山大道旁S10习水县沔山村新村S27凯里市三棵树镇S11安龙县洒雨镇S28凯里市麻江县坝芝乡S12贞丰县珉谷镇S29麻江县谷兵村S13兴义市兴仁县榜榜田S30贵定县治山镇国道旁S14遵义市红花岗区袁家寨大桥附近S31安顺市普定县S15遵义市汇川区团泽镇付家湾S32安顺市西秀区武当路S16绥阳县旺草镇萝柏小学附近S33紫云苗族布依族自治县猫营镇龙场村S17绥阳县大路槽乡园子S34贵阳市花溪区黔陶高坡乡

淫羊藿属于小檗科植物，具有补肾阳、强筋骨、祛风湿的功效，用于肾阳虚衰、阳痿遗精、筋骨痿软、风湿痹痛、麻木拘挛等症，是使用最为悠久、应用最为广泛的中药之一。最早记载于《神农本草经》，受到国内外广泛关注[1-2]。现代研究表明，淫羊藿尚有增强免疫、抗衰老、抗肿瘤、抗艾滋病等作用，常用于治疗骨质疏松、更年期综合症、乳房肿块、高血压、冠心病等疾病，因而具有巨大的研究和开发潜力[3-7]。而粗毛淫羊藿(EpimediumacuminaumFranch.)是我国西南地区淫羊藿药材使用种类的代表，因其药材中淫羊藿苷的含量较高，为贵州省中药材、民族药材质量标准所收载，现已成为贵州淫羊藿药材的主流品种之一，亦作为贵州省少数民族用药[8-11]。

近年来，随着中医药文化的发展，对淫羊藿需求也在不断扩大，造成了品种混乱、品质参差不齐的现象，而淫羊藿药材化学成分复杂，目前多以淫羊藿苷为指标评价其质量，但检测成分过于单一，不能较全面反映其他成分的情况，难以真正控制其质量。本研究采用HPLC法建立粗毛淫羊藿的指纹图谱，并结合聚类分析和主成分分析对不同产地药材进行评价，以期有效利用资源、减少药材产地带来的质量差异、筛选质量评价指标成分，为淫羊藿药材的鉴定和质量评价提供科学依据。

1 实验材料

1.1 仪 器

Thermo Fisher高效液相色谱仪(包括DAD检测器，UV检测器，自动进样系统，Thermo chromeleon 7色谱工作站)，Agilent InfinityLab Poroshell 120 SB-C18色谱柱(3.0 mm×100 mm，2.7μm)，AG 135型电子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；SG 8200 HPT型数控超声波清洗器(上海冠特超声仪器有限公司)，DK-98-Ⅱ型电热恒温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司)。

1.2 试 剂

无水乙醇、甲醇为分析纯(天津富宇精细化工有限公司)，实验用水为重蒸馏水，乙腈、甲醇为色谱纯(美国TEDIA)。

1.3 试药与对照品

34批样品均由本课题组野外采集，并经贵阳中医学院王悦云副教授鉴定为粗毛淫羊藿(EpimediumacuminaumFranch.)，叶片阴干打粉过3号筛备用。产地详情见表1。对照品为课题组前期所购买，包括朝藿定A对照品(批号MUST-13040209，纯度为99.40%)，朝藿定B对照品(批号MUST-13062312，纯度≥98%)，均购于北京神州科创生物科技有限公司；淫羊藿苷对照品(批号110737-200312)、朝藿定C对照品(批号为110756-200110)购于中国药品生物制品检定所[13]。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备

取淫羊藿药材粉末0.2 g，精密称定，置于50 mL具塞三角烧瓶中，精密加入50%乙醇溶液20 mL，称定重量，超声处理40 min(功率100 W，频率40 Hz)，冷却至常温，用50%乙醇溶液补足所失重量，摇匀过滤，过0.22μm有机微孔滤膜，取续滤液，即得。

2.2 色谱条件

Agilent InfinityLab Poroshell 120 SB-C18色谱柱(3.0 mm×100 mm，2.7μm)，流动相为乙腈(B)-水(C)，梯度洗脱0～5 min：25%～26%(B)；5～6 min：26%～34%(B)；6～11 min：34%～38.5%(B)；11～17 min：38.5%～100%(B)；17～20 min：100%(B)。进样量10μL，检测波长270 nm，流速0.8 mL/min，柱温30 ℃。

2.3 方法学考察

2.3.1 空白试验

为考察溶剂及流动相对淫羊藿指纹图谱的影响，取50%乙醇溶液，按“2.2”色谱条件进行测定。结果空白试验图谱基线平稳，表明试剂及流动相对淫羊藿指纹图谱测定没有干扰。

(平均数法，时间窗宽度为0.5)图1 34批不同产地粗毛淫羊藿指纹图谱叠加

2.3.2 完整性试验

取S 13号样品，按“2.1”的条件制备供试品溶液，按“2.2”色谱条件进行测定。为考察特征图谱记录的完整性，记录20 min后，以梯度结束时的流动相比例继续洗脱，并记录色谱图至60 min。结果色谱图在20 min后未出现色谱峰，表明采集20 min色谱图可基本记录完整淫羊藿药材化学成分信息。

2.3.3 精密度试验

取S 13号样品，按“2.1”的条件制备供试品溶液，按“2.2”色谱条件进行测定，连续进样6次。记录色谱图，并计算共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值。结果各共有峰相对峰面积RSD在0.78%～1.76%之间，各共有峰相对保留时间的RSD在0.01%～1.13%之间；将6次进样所得图谱导入国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2004.A版)软件(以下简称相似度软件)进行处理，与对照图谱相似度均大于0. 99，表明仪器精密度良好。

2.3.4 重复性试验

平行取S 13号样品6份，按“2.1”的条件制备供试品溶液6份，按“2.2”色谱条件分别进样分析，测得各共有峰的相对峰面积RSD在0.8%～2.85%之间，各共有峰的相对保留时间的RSD在0.01%～0.97%之间；将6份样品图谱导入相似度软件进行处理，与对照图谱的相似度均大于0.99，说明所用方法重复性良好。

2.3.5 稳定性试验

取S 13号样品，按“2.1”的条件制备供试品溶液，按“2.2”色谱条件进行测定，分别在第0，1，2，4，8，12，24，36，48小时进样，记录其色谱图，并计算共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD。各共有峰相对峰面积RSD在0.92%～2.92%之间，各共有峰相对保留时间的RSD在0.01%～0.97%之间；将所得图谱导入相似度软件进行处理，与对照图谱相似度大于0.98，表明供试品溶液在48 h内质量稳定。

2.4 指纹图谱的建立及评价

2.4.1 指纹图谱的建立及相似度评价

取34批不同产地粗毛淫羊藿样品按照“2.1”方法制备成供试品溶液，于“2.2”色谱条件进行检测。将所得色谱图分别导入相似度软件进行处理。得到34批粗毛淫羊藿指纹图谱叠加，见图1。药材的共有模式图谱见图2。以S 13的指纹图谱为参照图谱，对S 1～S 34的指纹图谱相关参数进行多点校正并自动匹配，设定时间窗宽度为0.5，按中位数法生成对照图谱，共标定20个共有峰，其中1号，2 号，3号，5号峰分别与朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C及淫羊藿苷对照品保留时间相一致(混合对照品图谱见图3)。各共有峰相对保留时间的RSD在0.02%～0.64%之间，各共有峰的相对峰面积RSD值在34.98%～255.96%之间。计算34批粗毛淫羊藿指纹图谱相似度，结果各产地与对照图谱相似度在0.606～0.959之间。

2.4.2 聚类分析

将34批样品指纹图谱中的20个共有峰峰面积z-score标准化，形成34×20阶数据矩阵，导入SPSS 16.0软件进行Q型聚类分析。运用组间连接法进行系统聚类分析，其中样品间距离的计算采用欧氏平方距离法，聚类结果见图4。

图2 粗毛淫羊藿药材的共有模式图谱

注：A为朝藿定A；B为朝藿定B；C为朝藿定C；D为淫羊藿苷。图3 混合对照品色谱图

图4 34批不同产地粗毛淫羊藿药材的聚类树状图

产地S 1和S 24首先被分出来聚为一类，在欧式平方距离为15时，产地S 12，S 18，S 13，S 11，S 31，S 27，S 26聚为一类，其他聚为一类，在欧式平方距离为10时，聚类趋势可分为6类，第1类为S 1和S 34，第2类为S 12，S 18，S 13，S 11，第3类为S 31，S 27，S 26，第4类为S 25，S 32，S 24，S 23，S 30，S 22，S 7，S 6，第5类为S 33，S 28，S 29，第6类为S 9，S 2，S 8，S 4，S 5，S 3，S 14，S 10，S 19，S 21，S 20，S 15，S 16，S 17。

2.4.3 主成分分析

用SPSS 16.0软件对34个贵州不同产地粗毛淫羊藿药材的20个变量(共有峰峰面积)原始数据进行标准化处理，以主成分的特征值及贡献率为依据，进行主成分因子分析，计算相关系数矩阵，主成分特征值、累积贡献率并计算主成分综合得分[13]，对各产地粗毛淫羊藿品质进行评价。

根据因子分析结果可得总方差解释表，对各变量进行因子提取和因子旋转的结果见表2。

根据各因子特征值大于1的原则及因子的方差累计贡献率达到85% 以上作为主成分提取的标准并结合表2，本试验需要提取的主成分主要有5个，其中提取主成分1的特征值为6.052，其贡献率为30.259%；提取主成分2的特征值为5.082，贡献率为25.408%；提取主成分3的特征值为3.753，贡献率为18.767%；提取主成分4的特征值为1.735，贡献率为8.677%，提取主成分5的特征值是1.099，贡献率为5.496%。这5个主成分的累积方差总贡献率达到88.607%，因此提取前5个主成分进行分析较为合适，即前5个主成分可以反映整体指标88.607%的信息。

根据因子分析可得成分矩阵，为了使提取的主成分能够更加清晰、集中、全面地反映原始数据所包含的内容，需要进行正交旋转[14]，得到20个指标在5个主成分中的旋转成分矩阵，结果见表3。

每个样本都是由数个变量属性特征构成的，这些属性特征之间的关系，则可以利用载荷图来对图像特征进行描述，载荷的绝对值越大，对于主成分的影响就越大，而这种影响可以通过载荷所代表的点到原点之间的距离来衡量。见图5。

表2 总方差解释变异量

成分 初始特征值 提取平方和载入 旋转平方和载入 合计方差(%)累计(%)合计方差(%)累计(%)合计方差(%)累计(%)16.05230.25930.2596.05230.25930.2594.94724.73424.73425.08225.40855.6675.08225.40855.6674.6223.10247.83533.75318.76774.4343.75318.76774.4344.00520.02467.85941.7358.67783.1111.7358.67783.1112.18110.90678.76551.0995.49688.6071.0995.49688.6071.9689.84288.60760.6133.06791.67470.4172.08793.76180.3391.69795.45890.3111.55597.013100.1450.72497.737110.1190.59798.335120.090.44898.782130.0640.32199.103140.0540.27199.374150.0420.2199.584160.030.1599.734170.0220.11199.845180.0170.08799.933190.0090.04599.978200.0040.022100

表3 成分矩阵

共有峰主成分12345Zscore(F1)0.5640.4880.4660.079-0.423Zscore(F2)0.7820.3340.4550.034-0.096Zscore(F3)0.706-0.0110.249-0.3510.479Zscore(F4)0.3280.4990.31-0.631-0.022Zscore(F5)0.8320.1290.3150.322-0.13Zscore(F6)0.8190.0610.4960.0530.077Zscore(F7)0.701-0.1870.452-0.0140.224Zscore(F8)0.651-0.2260.3950.5140.06Zscore(F9)-0.0910.48-0.1920.7080.158Zscore(F10)-0.0660.926-0.079-0.043-0.294Zscore(F11)0.0750.861-0.181-0.149-0.387Zscore(F12)0.0280.835-0.226-0.0470.461Zscore(F13)0.0150.787-0.3240.3840.156Zscore(F14)-0.1010.912-0.171-0.0020.226Zscore(F15)-0.4060.5970.38-0.1860.212Zscore(F16)-0.7820.0010.5060.2130.003Zscore(F17)-0.5660.0410.609-0.026-0.058Zscore(F18)-0.60.10.680.1930.081Zscore(F19)-0.5840.1490.73-0.160.016Zscore(F20)-0.6420.0940.6620.1350.035

图5 粗毛淫羊藿共有峰指纹图谱投影

主成分1方差贡献率最大，为30.259%，是最重要的成分群，结合表3和图4，以X轴为例，在投影图中选取距离原点较远的几个点，主成分1中的信息主要来自色谱峰2、3、5、6、16号，其中2号共有峰为朝藿定B，3号共有峰为朝藿定C，5号共有峰为淫羊藿苷，6号共有峰和16号共有峰为未知物质峰。

2.4.4 基于主成分分析建立贵州产粗毛淫羊藿质量综合评价模型

根据表2和表3，以X1、X2、X3、X4、X5代表5个主成分来作为34批不同产地粗毛淫羊藿成分所表达的信息，建立其品质的评价模型，得出成分的线性关系表达式分别为：

图6 产地综合得分分布

X1=0.564F1+0.782F2+0.706F3+0.328F4+0.832F5+0.819F6+0.701F7+0.651F8-0.091F9-0.066F10+0.075F11+0.028F12+0.015F13-0.101F14-0.406F15-0.782F16-0.566F17-0.6F18-0.584F19-0.642F20

X2=0.488F1+0.334F2-0.011F3+0.499F4+0.129F5+0.061F6-0.187F7-0.226F8+0.48F9+0.926F10+0.861F11+0.835F12+0.787F13+0.912F14+0.597F15+0.001F16+0.041F17+0.1F18+0.149F19+0.094F20

X3=0.466F1+0.455F2+0.249F3+0.31F4+0.315F5+0.496F6+0.452F7+0.395F8-0.192F9-0.079F10-0.181F11-0.226F12-0.324F13-0.171F14+0.38F15+0.506F16+0.609F17+0.68F18+0.73F19+0.662F20

X4=0.079F1+0.034F2-0.351F3-0.631F4+0.322F5+0.053F6-0.014F7+0.514F8+0.708F9-0.043F10-0.149F11-0.047F12+0.384F13-0.002F14-0.186F15+0.213F16-0.026F17+0.193F18-0.16F19+0.135F20

X5=-0.423F1-0.096F2+0.479F3-0.022F4-0.13F5+0.077F6+0.224F7+0.06F8+0.158F9-0.294F10-0.387F11+0.461F12+0.156F13+0.226F14+0.212F15+0.003F16-0.058F17+0.081F18+0.016F19+0.035F20

(注：表达式中各变量不是原始变量，而是标准化变量。)

将上述表达式，与所对应的5个主成分的方差贡献率做内积，得到粗毛淫羊藿质量综合评价函数X综合得分的表达式为：

X综合得分=(30.259X1+25.408X2+18.767X3+8.677X4+5.496X5)÷88.607

根据以上表达式得到不同产地粗毛淫羊藿得分值及排序，见表4。

3 结论与讨论

计算峰面积比值，每个样品的非共有峰面积占总峰面积的比值均小于20%，符合指纹图谱要求。相似度计算结果，34批样品不同产地中，有20批与对照图谱相似度大于0.9，11批与对照图谱相似度为0.8～0.9，3批与对照图谱相似度小于0.8，分别为0.606，0.789和0.798，各共有峰的相对保留时间RSD在0.2%～1.49%之间，相对峰面积RSD在17.37%～258.13%之间。贵州大部分产地的粗毛淫羊藿相似度不存在明显差异，表明不同产地淫羊藿所含化学成分基本相同，而共有峰峰面积RSD较大，表明不同产地的淫羊藿有效成分含量差别较大。

表4 贵州不同产地粗毛淫羊藿主成分得分、综合得分与排序

产地编号X1X2X3X4X5X综合得分排名S3414.955 2-1.3066.5692.513-0.7986.3201S115.208 1-6.2644.9090.6860.1374.5132S264.48610.909-2.226-0.824-2.5873.9483S314.5029.917-1.514-2.8350.0963.7894S274.2187.849-1.444-1.621-2.8753.0485S297.036 31.9610.448-2.7142.3922.9426S286.919 42.4290.299-3.6132.0832.8987S121.0259.451-4.4373.2781.3732.5268S95.3650.985-3.5772.1750.8801.6259S11-1.0835.6390.2392.522-0.0231.54310S55.777-2.6980.9060.230-1.0061.35111S25-6.0058.4434.540-1.411-0.5501.15912S35.958-5.8391.0220.267-0.0900.59713S13-2.5244.535-1.9714.0150.9600.47314S32-4.270-0.6829.2960.9210.8820.46015S22.686-2.796-1.7530.8550.530-0.13916S22-5.3271.6684.306-0.1210.932-0.38317S23-3.2510.4652.961-0.457-0.424-0.42118S18-4.6815.164-2.0980.4981.258-0.43519S41.440-3.464-0.2670.506-0.396-0.53320S80.610-3.361-0.2211.219-0.789-0.73221S30-5.057-1.0172.753-0.4540.606-1.44222S332.524-4.874-3.250-3.6141.134-1.50823S6-5.015-2.5583.468-0.585-0.758-1.81624S21-2.695-1.617-2.5620.6770.323-1.84025S24-12.7161.1536.656-0.439-0.217-2.65926S19-5.227-1.768-2.6190.6790.257-2.76427S17-3.446-2.132-4.473-0.522-0.123-2.79528S20-4.123-4.319-1.4180.484-0.280-2.91729S7-6.975-4.2763.267-0.914-0.615-3.04430S14-1.493-6.692-2.281-0.703-1.064-3.04731S16-3.280-3.325-4.807-0.674-0.060-3.16232S10-0.760-7.061-4.4790.039-0.811-3.27933S15-4.781-4.519-6.239-0.064-0.378-4.27934

聚类分析中S 1和S 24首先被分出来聚为一类，在欧式平方距离为15时，产地S 12，S 18，S 13，S 11，S 31，S 27，S 26聚为一类，其他聚为一类，说明产地S 1和S 34与其他产地有较大区别。作为贡献率最大的主成分1的得分排名前2的产地为S 1、S 34，总因子得分分别为15.208和14.955，与其他产地有较大差异，表明主成分分析结果与聚类分析较一致。

主成分1的信息来自色谱峰2、3、5、6、16号，其中2号共有峰为朝藿定B，3号共有峰为朝藿定C，5号共有峰为淫羊藿苷，6号共有峰和16号共有峰为未知物质峰，这5个成分可作为粗毛淫羊藿质量评价的指标。

综合得分越高，表明质量越好[15-19]，综合得分大于0的产地依次有贵阳市花溪区高坡乡(S 34)、贵阳市乌当区水田镇(S 1)、凯里市金山大道旁(S 26)、安顺市普定县(S 31)、凯里市三棵树镇(S 27)、麻江县谷兵村(S 29)、凯里市麻江县坝芝乡(S 28)、贞丰县珉谷镇(S 12)、贵阳市修文县六屯镇独山村(S 9)、安龙县洒雨镇(S 11)、长顺县营盘镇(S 5)、江口县唐古坡(S 25)、贵阳市花溪区燕楼乡(S 3)、兴义市兴仁县榜榜田(S 13)、安顺市西秀区武当路(S 32)，初步认为这几个产地的粗毛淫羊藿质量较好。综合得分小于-2.6的产地为印江县峨岭镇普同村(S 24)、毕节市黔西县新坪村(S 19)、绥阳县大路槽乡园子(S 17)、大方县大海坝森林公园附近(S 20)、石阡县聚凤乡指甲平村(S 7)、遵义市红花岗区袁家寨大桥附近(S 14)、绥阳县旺草镇萝柏小学附近(S 16)、习水县沔山村新村(S 10)、遵义市汇川区团泽镇付家湾(S 15)等产地，初步认为这几个产地的粗毛淫羊藿质量较差。

由于中药材受多方面因素的影响，其质量存在较大的差异，主成分分析能筛选出共有的特征成分，并指导发现决定性作用的化学成分，但由于中药化学成分复杂，很多可作为质量评价指标的成分未知，需进一步研究。运用聚类分析和主成分分析，可实现快速分析，发挥各自优势，互相验证和补充，多方面综合评判粗毛淫羊藿药材的质量。