凉都红香椿外植体快繁体系的研究

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(1.贵州农业职业学院， 贵阳 551400；2.贵州大学农业生物工程研究院/生命科学学院/山地植物资源保护与种质创新省部共建教育部重点实验室， 贵阳 550025)

香椿[Toonasinensis(A.Juss)Roem]属楝科(Meliaceae)多年生落叶乔木，喜光照，在昼夜温差较大且肥沃的沙质土壤中生长较好[1]。香椿原产于我国中部，目前在全国很多地方已大面积栽培，主要分布在黄河流域和长江流域之间，尤其以河北和山东栽种面积最多[2]。香椿树不仅作为良好的速生材，又是美味的木本蔬菜，具有较高的营养价值、药用价值和食疗价值[3]；研究表明，香椿叶含有多种生物活性物质，如没食子酸(gallic acid)、芦丁(rutin)、槲皮苷(quercitin)、儿茶酚(catechin)、表儿茶酚(epicatechin)、棕榈酸(palmitic acid)、油酸(oleic acid)、亚油酸(linoleic acid)、亚麻酸(linolenic acid)、β-谷甾醇混合物(a mixture ofβ-sitosterol)、豆甾醇(stigmasterol)、β-谷甾醇糖苷(β-sitosteryl-glucoside)、榈酸乙酯(ethylgallate)、

二十碳酸乙酯、正二十六烷醇、槲皮素、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、5,7-二羟基-8-甲氧基黄酮、杨梅素、杨梅苷等，具有较高的药用与保健价值[4]。尽管香椿作为食材两用的优良树种具有重要的经济价值，但在自然条件下，其繁殖主要是通过播种、扦插育苗、埋根、分蘖等无性繁殖方法进行[5]，而这些方法往往具有繁殖系数低、速度慢等缺点[6]。同时，香椿芽采收期短，受季节性影响明显，仅限于春季的采收，因此传统的栽培生产很难满足生产需要，不利于快速繁殖和优良品种的选育推广栽培[7]。植物组织培养是快速繁育良种的重要策略手段之一，可实现植物的产业化种植和生产需要[8]。本研究以凉都红香椿为材料，筛选获得可用于红香椿叶片外植体愈伤诱导和再生的培养基以及可促进红香椿枝条腋芽生长的培养基，旨在建立凉都红香椿的再生快繁体系，为红香椿的产业化种植、良种培育提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

凉都红香椿(ToonasinensisRoem)实生苗(树龄3～4年)和种子均由贵州归园居农业公司提供。枝条：于香椿适宜生长季节，选取当年生半木质化、腋芽健壮的枝条作为外植体。种子：挑选饱满、大小一致的新鲜香椿种子作为无菌苗萌发材料。MS培养基购于Phytotech公司，萘乙酸(naphthylacetic acid，NAA)、6-苄基嘌呤(6-benzyl aminopurine，6-BA)、激动素(kinetin，KT)和噻苯隆(thidiazuron，TDZ)均购于Sigma-Aldrich公司。

1.2 方 法

1.2.1 植物外植体选择

1) 无菌苗外植体获得。挑选新鲜、饱满的香椿种子用流水冲洗1 h后浸泡于蒸馏水中，37 ℃浸种24 h。之后依次经75%酒精溶液消毒20 s，0.1%升汞溶液消毒8 min，无菌水冲洗4～6次后用无菌滤纸吸取多余水分，撒播于种子萌发培养基(1/2 MS+0.5 mg/L GA3+0.05 mg/L NAA)上萌发培养。待无菌苗长出3～4片真叶时切下放置于愈伤诱导培养基上培养。

2) 成熟叶片及茎段外植体获得。摘取4—6月香椿新发幼嫩叶片或当年新萌发的幼嫩枝条(尚未木质化)去掉可见叶，置于流水中冲洗30 min。将材料转移至超净工作台内，并依次用75%酒精和0.1%HgCl2消毒一定时间，再用无菌水冲洗4～6次，分别将无菌叶片切成0.5 cm2的小叶块、无菌茎段材料剪成0.5～1.0 cm长的小茎段备用。分别接种外植体叶片愈伤诱导培养基和腋芽萌发培养基上培养。

1.2.2 愈伤诱导及植株再生

分别将上述无菌苗叶片切块、下胚轴切段以及成熟组织小叶块和茎段接种于愈伤诱导培养基上培养至愈伤形成，每10～14 d继代培养外植体1次。愈伤形成后转至芽分化培养基上继续培养至分化芽出现。选取长2～3 cm、长势好的无菌苗，小心将其从愈伤组织上剥离，接入生根培养基进行生根培养。

1.2.3 再生植株移栽

选取在生根培养基上生长至少有3～5条2.0 cm以上不定根的试管苗，在自然光条件下，封盖炼苗3～5 d，再开盖炼苗5～7 d，然后移栽到灭菌基质上。自来水冲洗去苗基部的培养基，移栽到已灭过菌的不同比例的腐殖质与碎炉渣的基质中生长。前期适当遮阴并保持湿度在85%～95%，逐步降至70%，15 d后去掉薄膜罩，定期喷洒40%多菌灵800倍液杀菌，5～7 d 1次，共计2～3次。

1.2.4 培养条件

基本培养基选用MS培养基，蔗糖含量30 g/L，生根诱导时不含大量元素且蔗糖减半，琼脂7 g/L，pH=5.8，培养温度(25±2)℃，光照强度2 000 lx，光周期12 h/d。所有培养基在121 ℃下高温灭菌20 min。

2 结果与分析

2.1 不同消毒剂和消毒时间对叶片和枝条的影响

由表1可知，用0.1%HgCl2对香椿叶片消毒6～8 min时效果最佳，叶片死亡率和成活率分别为10.5%和87.4%。当消毒时间超过8 min时，虽然叶片污染率降低，但叶片的成活率显著下降，为27.9%。长时间的HgCl2处理不仅可有效灭杀微生物，同时对植物外植体本身的毒害作用也较大，导致外植体褐变并最终死亡。根据取材香椿叶片的老嫩程度，可选择HgCl2处理时间为6～8 min。除了考虑成活率之外，低的死亡率也是组培成功的要素之一。因此，香椿叶片最佳的消毒剂和消毒时间为：75%酒精45 s、0.1%HgCl2(含2 d吐温80)6～8 min；香椿枝条最佳的消毒剂和消毒时间为：75%酒精45 s、0.1%HgCl2(含2 d吐温80)10～12 min。

表1 不同消毒剂和消毒时间对叶片的影响

消毒时间(min) 叶片 5%NaClO0.1%HgCl2污染率(%)死亡率(%)成活率(%)547.817.228.9822.110.587.4109.767.227.9571.315.819.4822.412.067.11010.777.618.8

表2 不同消毒剂和消毒时间对枝条的影响

消毒时间(min) 叶片 5%NaClO0.1%HgCl2污染率(%)死亡率(%)成活率(%)667.415.834.31226.09.378.81814.870.129.2673.822.218.51245.216.564.41821.265.832.7

2.2 不同培养基对枝条腋芽生长诱导及增殖的影响

以MS、1/2 MS为基本培养基，均附加0.2 mg/L GA3和0.02 mg/L NAA。培养30 d后进行统计观察，结果表明，在MS培养基上，接种的外植体腋芽萌发较早，生长快且叶色浓绿，效果较好，而1/2 MS培养基效果则相对较差，原因可能是营养元素减半对腋芽的生长不利(表3)。

表3 基本培养基对茎生长的影响

培养基处理样本数平均每株分蘖数平均芽苗高(cm)萌芽时间(d)MS303.81.785～71/2MS301.70.927～9

2.3 不同培养基对叶片愈伤组织诱导的影响

表3表明，2号培养基(MS+0.15 mg/L TDZ+0.3 mg/L NAA+1.0 mg/L KT)对愈伤组织诱导的效果最好，诱导率高达92.8%，诱导时间最短(6 d)。4号培养基(MS+0.3 mg/L TDZ+0.3 mg/L NAA+0.5 mg/L KT)的愈伤组织诱导率最低，为65.7%，且诱导时间也较长(10 d)。2号培养基(0.15 mg/L TDZ+0.3 mg/L NAA+1.0 mg/L KT)虽然也能获得最高的诱导率(86.8%)，但其愈伤组织结构较为松散，且容易老化呈黄褐色，不利于再生芽的分化(表4)。

表4 不同培养基对愈伤诱导的影响

培养基编号 培养基附加成分(mg/L) 愈伤组织诱导 TDZNAAKT天数(d)诱导率(%)10.150.10.5965.620.150.31.0676.430.30.11.01056.840.30.30.51223.9

2.4 不同培养基对再生芽生根的影响

将高2.0 cm以上生长健壮的小苗，切除茎基部1～2 mm部分转入生根培养基中，发现1/2 MS+0.5 mg/L NAA对香椿的生根率效果最佳，可达90.9%，主根数为4.3根，根长平均为6.6 cm。5号培养基(MS+0.9 mg/L NAA)的生根率在5种培养基中最低，仅为21%，主根数为2.1根(表5)。

2.5 生根苗移栽

从表6可以看出，腐殖质∶碎炉渣(1∶1)基质的移栽成活率最高，香椿无菌苗移栽成活率达76.7%。比例为腐殖质∶碎炉渣(2∶1)的基质移栽成活率较低，以腐殖质∶碎炉渣(3∶1)的基质移栽成活率最低，仅为56.7%。

选取香椿叶片在筛选得到的最佳消毒条件以及最佳培养基上培养，得到长势良好的香椿植株(图1)。

3 讨 论

香椿作为我国传统的名贵木本蔬菜，除了色香味俱佳外，还含有丰富的营养成分[3]。香椿的传统育种周期较长、繁育系数低、耗时费力，严重阻碍了香椿产业化的发展[9]。植物生物技术的发展，尤其是细胞工程和基因工程理论和实践的突破，为快速繁殖优良品种、改良品种和培育新品种开辟了新的途径[7]。目前，以植物细胞工程为基础的植物组织培养技术已广泛地应用到花卉、药用植物、农林蔬菜经济作物的快速繁殖上，为推动农业产业化，增加国民经济收入起到了十分重要的作用[10]。本研究以香椿无菌苗、成熟叶片及幼嫩茎段为材料，通过配制不同培养基组合，优化筛选了适于香椿愈伤组织诱导、幼芽分化及植株生根的培养基。同时对再生苗的移栽基质及条件控制进行探索，以期为快速培育凉都红香椿、建立香椿种子苗圃及开发和利用香椿树种，并最终推动地区产业化发展提供理论依据。

表5 NAA的生根效应

培养基编号NAA浓度(mg/L)处理样本数生根株数生根率(%)每株平均生根条数10.1453373.32.820.3524280.83.530.5555090.94.340.7644570.33.350.9603456.72.1

表6 基质对生根苗成活率的影响

基质移栽株数(株)成活株数(株)成活率(%)腐殖质∶碎炉渣(1∶1)655280腐殖质∶碎炉渣(2∶1)583865.5腐殖质∶碎炉渣(3∶1)623251.6

本研究可广泛利用香椿无菌苗、成熟叶片及幼嫩茎段组织作为外植体进行组培再生，具有以下优点：第一，外植体取材广泛。前期研究表明，针对不同香椿外植体需要调整不同的培养，本研究针对不同来源的外植体材料均可采用相同的愈伤诱导培养基、幼芽分化培养基以及生根培养基进行培养；第二，愈伤组织分化率高。利用该培养基配方形成的愈伤组织色泽黄绿、结构致密，利于后续的继代及分化培养，与之前报道的愈伤诱导培养基相比，成分简单，无需复杂的配方，大大节约成本；第三，重复性与普遍性高。对材料的处理方式统一，简便，易重复。第四，经济效益高。通过组织再生实验发现，本研究得出的培养基配方能较好地诱导愈伤组织分化出嫩芽，并最终形成完整的植株。同时，移栽过程中对基质和环境条件的探索为提高香椿的移栽存活率提供了理论保障。

注：A为叶片培养；B为叶片继代培养；C为叶片愈伤诱导；D为愈伤分化幼芽；E为植株再生。图1 香椿组织培养