基于三黄泻心汤的黄芩—大黄—黄连不同剂量配伍对黄芩苷和汉黄芩苷溶出的影响

邓丽红　谢臻　陈勇　李耀华　庞婷

中圖分类号 R284；R927.2 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2018）03-0334-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.03.11

摘 要 目的：基于三黄泻心汤（简称“泻心汤”）考察黄芩-大黄-黄连不同剂量配伍对黄芩苷和汉黄芩苷溶出的影响，为研究中药复方药味剂量组成配伍的化学机制提供参考。方法：以高效液相色谱法测定黄芩苷、汉黄芩苷含量。固定黄芩剂量（3 g）不变，以大黄和黄连的不同剂量为因素，黄芩苷和汉黄芩苷的溶出率为响应值，设计二因素五水平星点试验，采用响应面法优化黄芩-大黄-黄连最佳剂量配伍，并与经典剂量泻心汤（黄芩3 g、大黄6 g、黄连3 g）比较其中黄芩苷和汉黄芩苷溶出率的变化。结果：黄芩、大黄、黄连的剂量分别为3、1.76、0.17 g时提取液中黄芩苷和汉黄芩苷的总溶出率最高，验证试验中黄芩苷和汉黄芩苷的总溶出率平均为21.89%（RSD=0.46%，n=3），与预测值22.54%的相对误差为2.88%；与经典剂量泻心汤比较，最优配伍剂量黄芩-大黄-黄连提取液中黄芩苷和汉黄芩苷总溶出率提高了47.21%。结论：基于泻心汤的黄芩-大黄-黄连不同剂量配伍对黄芩苷和汉黄芩苷溶出有一定影响，当黄芩、大黄、黄连的剂量分别为3、1.76、0.17 g时其溶出率高于经典剂量。

关键词 三黄泻心汤；黄芩苷；汉黄芩苷；剂量配伍；星点设计；响应面法；溶出率

ABSTRACT OBJECTIVE： To investigate the effects of different dose compatibility of Scutellaria baicalensis-Rheum palmatum- Coptis chinensis based on Sanhuang Xiexin decoction （shorted for Xiexin decoction） on dissolution rate of baicalin and baicalein， and to provide reference for studying chemical mechanism of TCM compound dose composition compatibility. METHODS： HPLC method was used to determine the contents of baicalin and baicalein. By fixing the dose of S. baicalensis （3 g）， using the dose of R. palmatum and C. chinensis as factors， dissolution rate of baicalin and baicalein as response value， two-factor and five-level central composite test was designed. The optimal dose compatibility of S. baicalensis-R. Palmatum-C. chinensis was optimized by response surface method， and compared with the dissolution rate of baicalin and baicalein in classic dose Xiexin decoction （S. baicalensis 3 g， R. Palmatum 6 g， C. chinensis 3 g）. RESULTS： When the doses of S. baicalensis， R. palmatum， C. chinensis were 3， 1.76， 0.17 g， total dissolution rate of baicalin and baicalein was the highest in extract. The average total dissolution rate of baicalin and baicalein in validation test was 21.89% （RSD=0.46%， n=3）， and the relative error was 2.88% with the predicted value of 22.54%. Compared with the classical dose of Xiexin decoction， the total dissolution rate of baicalin and baicalein in the optimum dose of S. baicalensis-R. Palmatum-C. chinensis in extract was increased by 47.21%. CONCLUSIONS： The different dose compatibility of S. baicalensis-R. Palmatum-C. chinensis based on Xiexin decoction influence the dissolution of baicalin and baicalein to certain extent. When the doses of S. baicalensis， R. palmatum， C. chinensis are 3， 1.76， 0.17 g， dissolution rate of baicalin and baicalein are higher than that of classic dose.

KEYWORDS Sanhuang Xiexin decoction； Baicalin； Baicalein； Dose compatibility； Central composite design； Response surface methodology； Dissolution rate

三黃泻心汤（后文简称“泻心汤”）出自《金匮要略》，其药物组成为大黄二两（6 g）、黄连一两（3 g）、黄芩一两（3 g），水煎后服用，具有清心泻火、凉血止血的功效，主治心火内盛、迫血妄行及症见吐血衄血、便秘溲赤者[1]。现代临床应用显示，泻心汤适应证较广泛，且临床疗效较好[2-4]。蒽醌类、黄酮类和生物碱类成分是泻心汤中的主要活性成分[5]，同时也是多种中草药的有效成分。文献报道，黄酮类化合物具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抑菌、调节心血管等药理作用[6-10]，而黄芩中含有黄芩苷、汉黄芩苷等黄酮成分[11]。泻心汤的经典剂量比例为大黄-黄芩-黄连（2 ∶ 1 ∶ 1）。目前，对本方的药理作用研究较多，但是对泻心汤中黄芩-大黄-黄连不同剂量配伍是否会引起其中黄芩苷和汉黄芩苷的溶出变化还未可知。许多学者利用数学方法进行化学成分变化规律的研究，如均匀设计法、正交设计法、偏最小二乘法等[12]，与均匀设计法、正交设计法比较，星点设计法具有试验次数较少、精度较高等优点[13]。故本研究以黄芩苷和汉黄芩苷溶出率为响应值，采用星点设计-响应面法优化黄芩-大黄-黄连的最佳剂量配伍，为研究中药复方药味剂量组成配伍的化学机制提供参考。

1 材料

1.1 仪器

2695型高效液相色谱仪，包括2998PDA检测器、四元梯度泵、在线脱气机、自动进样器、Empower3工作站（美国沃特世科技有限公司）；BP211D型电子分析天平（德国Sartorius公司）；FW17型中草药打粉机（天津泰斯特仪器设备有限公司）；HWS24型电热恒温数显水浴锅（上海一恒科技有限公司）；TGL-16G型高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）。

1.2 药材、药品与试剂

中药饮片大黄、黄连、黄芩（广州康美药业股份有限公司，批号：161008891、161106631、161105141）；黄芩苷对照品、汉黄芩苷对照品（上海融禾医药科技有限公司，批号：160624、160711，纯度：均≥98%）；甲醇、磷酸均为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 泻心汤中黄芩苷和汉黄芩苷的含量测定

2.1.1 色谱条件 色谱柱：Thermo Syncronis C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇（流动相A）-0.2%磷酸水溶液（流动相B），梯度洗脱（0～10 min，45%A；10～55 min，45% A～70%A；55～56 min，70%A～45%A）；流速：1.0 mL/min，柱温：25 ℃；检测波长：280 nm；进样量：5 μL。

2.1.2 溶液的制备 （1）混合对照品溶液的制备。精密称取黄芩苷、汉黄芩苷对照品适量 ，分别置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解至刻度，作为贮备液。分别精密移取一定量的上述贮备液至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，分别制成每1 mL溶液中含黄芩苷 0. 050 22 mg、汉黄芩苷0.008 08 mg的混合对照品溶液，然后以离心半径为16 cm、13 000 r/min离心10 min，取上清液，备用。

（2）不同剂量配伍黄芩-大黄-黄连提取液的制备。精密称定黄芩药材粉末3 g，按表2星点设计试验，精密称定相应量大黄、黄连粉末，置于圆底烧瓶中，加入30倍量水，称质量；浸泡30 min，加热回流提取20 min，放冷；补足减失的质量，滤过，得泻心汤提取液。

（3）供试品溶液的制备。精密移取“2.1.2（2）”项下提取液（按方案9制备）1 mL，转移至10 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，以离心半径为16 cm、13 000 r/min离心10 min ，取上清液，得供试品溶液。

（4）缺黄芩阴性样品溶液的制备。按“2.1.2（2）”项下剂量精密称定大黄、黄连粉末并进行相应处理后，得到缺黄芩的提取液，精密移取缺黄芩的提取液1 mL，按“2.1.2（3）”项下方法操作得缺黄芩阴性样品溶液。

2.1.3 方法学考察 （1）专属性试验。分别取混合对照品溶液、供试品溶液和缺黄芩阴性样品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定。结果，其他组分不干扰黄芩苷和汉黄芩苷的测定，分离度均大于1.5，方法专属性和选择性好，色谱图见图1。

（2）线性关系考察。分别取“2.1.2（1）”项下混合对照品溶液2、4、6、8、10、12、14 μL，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定。以混合对照品进样量 （x，μg）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，得黄芩苷回归方程为y=3×106x-123 389（r=0.999 9），检测进样量线性范围为0.100 44～0.703 08 μg；汉黄芩苷回归方程为y=4×106x-325 13（r=0.999 9），检测进样量线性范围为0.016 16～0.113 12 μg。

（3）精密度试验。取“2.1.2（3）”项下同一供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，重复进样6次。结果，黄芩苷、汉黄芩苷峰面积的RSD值均小于2.0%（n=6）。

（4）稳定性试验。取“2.1.2（3）”项下同一供试品溶液，分别放置0、2、4、8、12、24 h后按“2.1.1”项下色谱条件进样测定。结果，24 h内，黄芩苷、汉黄芩苷峰面积的RSD值均小于2.0%（n=6）。

（5）重复性试验。精密移取“2.1.2（2）”项下同一泻心汤提取液1 mL，共6份，按“2.1.2（3）”项下方法制备成供试品溶液，然后按“2.1.1”项下色谱条件进样测定。结果，黄芩苷、汉黄芩苷峰面积的RSD值均小于2.0%（n=6）。

（6）准确度试验。精密移取“2.1.2（2）”项下同一泻心汤提取液0.5 mL ，共6份，分别精密加入一定量的混合对照品溶液，按“2.1.2（3）”项下方法制备溶液，然后按“2.1.1”项下色谱条件进样测定。结果，黄芩苷、汉黄芩苷平均加样回收率分别为99.66%、99.57%，RSD值均小于2.0%（n=6）。

2.2 星点设计-响应面法优化黄芩-大黄-黄连剂量配伍

2.2.1 星点设计 因泻心汤中黄芩苷和汉黄芩苷来自黄芩，故固定黄芩的剂量不变（均为3 g），以大黄（X1）、黄连（X2）的量为考察因素，以黄芩苷、汉黄芩苷溶出率之和（Y）为指标（响应值），采用星点试验法设计黄芩-大黄-黄连的配伍剂量[14]。因素与水平见表1，星点设计试验结果见表2。

2.2.2 模型拟合 以大黄（X1）、黄连（X2）的量为自变量，以Y值为因变量，对试验结果进行多元线性回归和二项式拟合，以方程的P<0.05作为显著标准，选择有较大r值的模型，得多元线性方程为Y=19.945 19+0.5579 2X1- 2.893 49X2（r=0.982 7，P<0.05）；拟合的二项式方程为Y=23.137 20-3.672 07X2-0.013 09X12-0.106 55X22+0.236 43X1X2（r=0.997 0，P<0.05），复相关系数r=0.997 0，相对多元线性拟合有提高，表明该方程有较大的可信度，预测性较好。简化的二项式拟合结果见表3。

由表3可知，一次项X2、二次项X22、交互项X1X2对黄芩苷和汉黄芩苷溶出率均有显著影响（P<0.05），特别是X2项影响最为显著，提示黄连的量的微小变化即对黄芩苷和汉黄芩苷的溶出有较大影响。

2.2.3 响应面法优化黄芩-大黄-黄连剂量配伍 大黄与黄连的量对黄芪类成分溶出有交互作用。固定黄芩和大黄的量不变时，增大黄连的量，Y值降低；固定黄芩和黄连的量不变，增大大黄的量，Y值有较小幅度的增大，见图2。

应用LINGO 9.0软件求导后可得：当黄芩的量为3 g、大黄的量为1.76 g、黄连的量为0.17 g 时，有最大Y值22.54%。故本试验最终选取黄芩-大黄-黄连的最优剂量配伍为黄芩3 g、大黄1.76 g、黄连0.17 g。

2.2.4 验证试验 根据最优剂量比例提取黄芩-大黄-黄连溶液3份，按照前述方法测定其中黄芩苷和汉黄芩苷的溶出率。结果所制3份黄芩-大黄-黄连提取液中黄芩苷和汉黄芩苷平均总溶出率为21.89%，与预测值22.54%的相对误差为2.88%（n=3），可见预测性较好。

2.3 最优配伍剂量黄芩-大黄-黄连提取液与经典剂量泻心汤中黄芩苷和汉黄芩苷溶出率比较

分别按黄芩-大黄-黄连最佳剂量配伍（黄芩3 g、大黄1.76 g、黄连0.17 g）和经典剂量比例（大黄6 g、黄连3 g、黄芩3 g）泻心汤制备提取液，按前述方法处理并测定其中黄芩苷与汉黄芩苷的总溶出率（两种剂量的总溶出率分别用Y1、Y2表示），并计算最优配伍剂量黄芩-大黄-黄连提取液中黄芩苷和汉黄芩苷溶出率的增加率（%）[（│Y2-Y1│）/Y2×100%]，结果见表4。

表4 最优配伍剂量黄芩-大黄-黄连与经典剂量泻心汤中黄芩苷和汉黄芩苷溶出率比较结果（%）

Tab 4 Comparison of dissolution rate of baicalin and baicalein in optimal dose of S. baicalensis- R. palmatum-C. chinensis and classic dose of Xiexin decoction（%）

[试验号 Y1 Y2 增加率 1 21.98 14.84 48.11 2 21.91 14.79 48.14 3 21.78 14.97 45.80 平均值 21.89 14.87 47.21 ]

3 讨论

固定黄芩的剂量不变，只改变其他2味中药的剂量，是考虑到泻心汤中的黄芩苷和汉黄芩苷来自黄芩，固定黄芩在整方中的量不变，更便于比较大黄、黄连量的变化对泻心汤中黄芩苷和汉黄芩苷溶出的影响。本研究应用星点设计-响应面法优化不同剂量配伍黄芩-大黄-黄连提取液中黄芩苷和汉黄芩苷溶出变化，本次建立的二项式拟合模型是科学、合理、有效的，建立的方程能够较好地预测黄芩苷、汉黄芩苷的总溶出率，具有现实指导意义。本研究结果显示，大黄剂量的变化对黄芩苷和汉黄芩苷溶出的影响相对于黄连小，可能是酸性成分之间（即大黄中酸性成分与黄芩中黄酮酸性成分）相互作用弱于酸性、碱性成分之间（即黄芩中黄酮酸性成分和黄连中碱性成分）的相互作用的缘故[15]。

在星点设计试验中，由于大黄与黄连剂量在变化，大黄、黄连有效成分的溶出也将会受到影响。若要同时考察大黄、黄连有效成分的溶出变化，则需要考虑的影响因素太多，限于篇幅有限，故本研究未展开研究。泻心汤中黄芩泻肺燥湿解毒，黄连泻心清胃、燥湿解毒，大黄泻火通肺泻毒、引火下行。可见，黄芩、黄连与大黄都对泻心汤的泻火解毒这一功效有重要影响。因此，本研究将在后续研究中分别考察三者不同剂量配伍对大黄、黄连有效成分溶出变化的影响。

黄芩-大黄-黄连提取液中黄芩苷和汉黄芩苷的溶出率与配伍比例呈现非线性变化。当黄芩-大黄-黄连提取液中黄芩、大黄、黄连的剂量分别为3、1.76、0.17 g时，黄芩苷、汉黄芩苷总溶出率较经典比例泻心汤增加了47.21%，这可能会提高黄芩-大黄-黄连提取液的临床疗效。但是黄芩-大黄-黄连提取液的药效不仅与其中黄芩苷和汉黄芩苷溶出率有关，还需要对其他的有效成分进行测定及药理试验验证，才能更深入地探究不同剂量配伍对黄芩-大黄-黄连提取液中有效成分的影响，这有待后续试验进一步完善。

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（收稿日期：2017-08-21 修回日期：2017-10-08）

（編辑：林 静）