红细胞微粒与深静脉血栓形成关系的研究进展

张喆婷 徐新 张社兵

随着科技发展，人们对细胞微粒（microparticles，MPs）的认识不断提高。虽然MPs的产生过程未被阐明，但普遍认为MPs是血液中细胞活化和凋亡过程中通过细胞的胞吐作用产生的一种直径为0.1～1.0 μm的小囊泡。大量的基础和临床研究表明，血栓性疾病与凝血因子、血小板、血管内皮细胞、组织因子有关。近几年的研究发现，MPs也在其中发挥重要作用，其中红细胞微粒（erythrocyte-derived microparticles，ErMPs）具有调节炎症反应[1,2]及激活凝血系统[3,4]的作用。Wu等[5]报道，血栓性疾病患者血液中ErMPs水平明显升高。由此可见，探究ErMPs是否可成为一种预测深静脉血栓形成等血栓性疾病进展及预后的新标志物显得十分有意义。本文就微粒结构、红细胞微粒产生、促凝活性以及与深静脉血栓形成关联性进行阐述，以期为后续深入研究提供基础。

1 深静脉血栓形成（DVT）概述

深静脉血栓形成（deep venous thrombosis，DVT）是指血液在深静脉内非正常凝结，属于一种静脉回流障碍性疾病，在临床较为常见。其发病率占周围血管疾病的40%。DVT的并发症多为肺栓塞、股白肿或股青肿及慢性静脉功能不全综合征等。无论是深静脉血栓本身还是其并发症，均可影响患者的工作及生活质量甚至导致死亡。并且据报道，约30%的静脉血栓患者经抗凝治疗后5年间仍存在一定的复发可能性[6]。流行病学调查报道，美国静脉血栓每年新发病例超过100万例；在国内尚缺乏DVT发病率确切的统计数据，但是其发病率有逐年上升趋势。目前由于患者对DVT意识不足、诊断缺乏早期精确指标、抗凝治疗周期长及INR值监测频繁等众多因素，故患者依从性差，疾病的诊治及预后并不理想。因此，寻找一种能早期精准诊断DVT的生物学标志物显得尤为重要。

2 MPs概述

MPs是在各种刺激因素下（如血流切应力、补体攻击、氧化应激及凋亡前刺激等）真核细胞活化或凋亡时的产物，可循环于人类外周血中。相关研究发现，MPs含有丰富的母细胞的表面蛋白、脂质和胞质成分，如表面受体、细胞因子、磷脂、信使核糖核酸（mRNA）和小分子核苷酸（microRNA）。Rank等[7]的研究提及，MPs的生命半周期平均为5.8 h。从MPs分类而言，根据细胞来源，MPs分为血小板源性的MPs（PMPs）、白细胞源性的MPs（LMPs）、红细胞源性微粒（ErMPs）、巨噬细胞源性MPs、内皮细胞源性MPs（EMPs）及癌细胞源性MPs等多个类型。不同源性MPs表达不同的促凝物质，其促凝方式也存在一定差异。

随着MPs的临床应用研究越来越多，MPs的检测技术也不断增多，应用最广泛的为流式细胞仪（FACS）。同时运用免疫荧光技术还可以精确地检测到细胞微粒的数目和来源。

Nomura等[8]的研究证实，不同起源细胞的MPs具有不同的表面标记物，如PMPs可表达CD41a、CD62P及Annexin V等，EMPs可表达CD31、CD144及Annexin V等。而Grisendi等[9]则发现，ErMPs的表面标志物为CD235a（+）及Annexin V等。故根据MPs大小和表面标记物，可以更准确地检测出不同来源的MPs。目前人们对PMPs、LMPs及EMPs研究较多，对ErMPs的认识较少。

3 ErMPs概述

ErMPs是指红细胞在各个因素刺激下发生活化或凋亡反应时所释放的一种产物。随着关于ErMPs的蛋白组学研究的不断深入，有研究报道，ErMP组成成分与红细胞存在一定的区别，但ErMPs可表达某些红细胞的表面蛋白抗原［如CD235a（+）］[8]。并且不同的刺激因素可引起ErMPs组成成分发生相应的变化，现已发现的主要成分有含Band3蛋白、血型糖蛋白A、补体蛋白和GPI锚定蛋白等。

4 ErMPs的检测

目前ErMPs的检测技术多种多样，常用的方法有显微镜观察、酶联免疫吸附法（ELISA）、流式细胞仪（FACS）和蛋白组学等。FACS的操作方法简便快捷，并且可进行荧光标记检测，使其成为临床检测ErMPs的重要方法[10]。随着技术的发展，FACS不仅可以检测到直径最小约0.1 μm的ErMPs，还可以对其进行定量分析。近年来，国外相关研究证明，通过CD235a（+）、膜联蛋白V及二醋酸羟基荧光素琥珀酰亚胺脂（CFSE）三者同时与ErMPs表面蛋白抗原结合，可以更有效地测定血液中ErMPs的数量[8]。

5 ErMPs的促凝作用

5.1 ErMPs与内皮细胞 众所周知，正常的血管内皮细胞具有调节凝血和抗凝血等作用，血管内皮细胞里产生的一氧化氮（NO）可进入血小板细胞，使血小板活性降低，抑制其凝集和向血管内皮黏附，从而防止血栓的形成。当内皮细胞功能受到损伤时可促进凝血反应发生，进而促进血栓形成。由此推测血管内皮细胞损伤与DVT的发生有密切关系。

当红细胞发生活化或凋亡反应时，将释放含有血红蛋白的ErMPs及游离的血红蛋白，其中所含有的亚铁离子可迅速与NO结合，以比红细胞快1000倍左右的清除速度把NO从体内清除，进而达到降低NO生物利用度的目的[11]。当NO生物利用度下降后，血小板便更容易被激活，从而增加血栓形成的风险。大量研究已证实NO作用于平滑肌细胞时，平滑肌松弛，引起血管舒张作用。Camus等[12]报道，ErMPs、游离血红蛋白具有收缩血管的作用，从侧面提示ErMPs及游离红细胞在NO清除过程中起一定作用。由此表明ErMPs可通过降低NO生物利用度而达到促凝的作用。

5.2 ErMPs与PS外翻 相关研究发现，ErMPs的膜主要为双层磷脂，由脂类、蛋白质及糖类组成。静息状态下，各种磷脂不对称地分布于细胞膜两侧分布于细胞膜外侧的为磷脂酰胆碱和鞘磷脂，而磷脂酰乙醇胺（phosphatidyiethanolamine，PE）和磷脂酰丝氨酸（hosphatidylserine，PS）则分布于内层，这种不对称性需要消耗能量来维持。当红细胞激活或凋亡后释放ErMPs，其位于膜内侧的大量PS（带负电荷）外翻，更易与凝血蛋白上的γ－羧基谷氨酸酶结构域（带正电荷）发生静电反应，更容易与凝血因子结合，从而进一步促进凝血反应[13]。众所周知PS作为凝血启动和吞噬识别过程中重要的信号分子，可有效地促进凝血因子FX的激活和凝血酶生成，从而促进血栓的形成。Guo等[14]的研究发现，合并DIC的急性早幼粒细胞白血病（acute promyelo cytic leukemia，APL）患者血浆中PS呈高表达水平PS表达水平对评估血栓形成倾向有一定的意义Mankelow等[15]的研究表明，SCD患者的高凝状态可能与携有PS促凝微粒的红细胞存在密切关系由此推测，PS外翻在深静脉血栓形成过程中发挥着一定的促凝作用。

5.3 ErMPs与TF表达 组织因子（tissue factor TF）是一种跨膜糖蛋白，是体内凝血途径的主要启动因子。TF主要以在微粒上表达的形式存在，这种微粒即为TF+MPs，其促凝作用最大。相关研究已证实TF+MPs的促凝活性高于无TF表达的MPs约10倍[16]。有研究[17]表明，MPs表面可表达组织因子TF，ErMPs也不例外。当组织和血管损伤后释放TF，TF与凝血因子Ⅶ/活化凝血因子Ⅶa（FⅦ/FⅦa结合，从而启动外源性凝血反应[18]。因为TF是FⅦⅦa的受体，其对FⅦ/FⅦa有很高的亲和力，当红细胞活化或凋亡时产生ErMPs，其表面表达TF时更容易结合FⅦ/FⅦa，从而形成凝血起始复合物激活FX和FIX启动凝血，故增强了ErMPs的促凝活性。

6 ErMPs与深静脉血栓形成关系

DVT是临床常见病、多发病。1946年，Virchow提出：DVT三大发病原因为静脉壁损伤、血流缓慢和血液高凝状态。目前对此理论有了更多新的认识，尤其是DVT发病相关高危因素受到了重视。目前普遍认为内在和环境因素（年龄、制动、原发性高凝状态、血型、地域差异、肥胖）、手术和创伤、静脉留置导管、疾病因素（恶性肿瘤、SLE、炎症性肠病）、女性特殊因素（妊娠、口服避孕药）等是深静脉血栓形成的高危因素[19]，但其确切发病机制还不清楚。

目前相关研究发现，MPs已经涉入广泛疾病谱，包括心血管疾病、糖尿病、炎症状态、败血症、抗磷脂抗体综合征、血栓性血小板减少性紫癜和癌症等。而这些疾病常导致血栓形成的高凝状态。Zhou等[20]提出MPs在静脉血栓栓塞症（VTE）的病理生理过程中发挥重要作用。从病理学角度分析，血栓性浅表静脉炎病理变化特点是静脉壁有不同程度的炎症、增厚和血管腔内血栓形成。而静脉血流滞缓和血液高凝状态等情况往往可引起深静脉血栓形成，其血栓主要组成部分为红细胞、血小板及少量纤维蛋白等。由此推测，由红细胞释放的ErMPs在深静脉血栓形成中也起到一定作用。

大量的研究表明，MPs是几种病理生理过程中的关键效应物，如内皮损伤和功能障碍、斑块破裂、新生血管形成及急性血栓形成等。Jia等[21]的研究提及外周血中的PMPs可与ErMPs结合形成结合体，并通过试验发现冠心病血淤证患者外周血中结合体呈高表达水平，由此推断ErMPs在血淤证中发挥一定作用。而Amabile等[22]也提出，随着患者血浆MPs水平的升高，患者发生动脉粥样硬化、血栓形成及急性冠状动脉疾病的风险也随之升高。同时也证实静脉血栓栓塞患者的血浆中可检测到CD31（+）-EMPs，而慢性肾衰竭合并内皮细胞功能障碍患者的血浆中可检测到ErMPs，但DVT与ErMPs相关性仍需不断探究。

Suades等[23]的研究发现，急性ST-T段抬高型心肌梗死患者外周血中ErMPs及CD235a（+）的表达水平较健康对照组显著升高，并且进行再灌注治疗后ErMPs及CD235a（+）表达水平呈明显下降趋势。此研究发现，冠状动脉血栓患者的外周动脉血中ErMPs水平高表达，表明外周血中ErMPs定量可用作急性期动脉血栓形成的敏感标记物。Suades等[23]表示，将进一步深入探究CD235a（+）-ErMPs在预测静脉血栓形成中的评估价值。

近年来，国外有研究报道，血液-骨髓细胞源性的TF在某些疾病患者外周血中呈高表达水平，尤其是静脉血栓疾病[24]。众所周知，APL患者为下肢静脉血栓形成好发人群，Zhang等[25]的研究证实，APL-BM-MNC来源微粒具有明显的促凝活性。而其中ErMPs是否亦发挥相应作用仍需深入研究。Tesselaar等[26]首次描述了TF+MPs与急性静脉血栓的关系。这项研究表明，合并VTE的胰腺癌和乳腺癌患者体内TF+MPs水平最高，并且TF+MPs活性明显高于健康个体及自发性VTE患者。Zwicker等[27]也得出相似的结论，胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、直肠癌患者体内TF+MPs高表达，原未合并静脉血栓的癌症患者其1年内发生血栓率为38%，且均为TF+MPs高表达患者，不高者发生率为0。Thaler等[28]则提及TF与癌症组织学分级、血管相关侵袭、血管生成和静脉血栓栓塞的发生具有相关性，并证实高活性的TF-MP存在于低分化的胰腺癌表型中，其可浸润胰周血管。因此，TF+ErMPs可能参与静脉血栓形成的过程。

最近国外有关MPs的研究报道，MPs高表达可能增加自身免疫性疾病患者发生血栓事件的风险。Niccolai等[29]报道，ErMP可能在血栓形成中具有一定作用，尤其是慢性溶血性疾病，如地中海贫血（halassemia）、镰状细胞病（sickle cell disease，SCD）及阵发性睡眠性血红蛋白尿（paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH）等。相关研究证实，溶血过程中红细胞裂解所产生的ErMPs能够激活内源性凝血途径，促进凝血酶的生成[30]。

近年来，人们对ErMPs与慢性溶血性疾病患者合并血栓性疾病的关注不断增加。例如Sun等[31]报道中提及，中间型地中海贫血患者脾切术后，血浆中ErMPs数量较术前急剧增多。

Camus等[32]通过大鼠模型实验证实，SCD来源的ErMPs可引起大鼠血管闭塞及肾、脑血液灌流的减少，且随着MPs剂量的增加，其血管闭塞持续时间延长。Kozuma等[33]的研究表明，PNH患者发生溶血反应时常伴有血栓形成，其外周红细胞释放的MPs的促凝活性促进PNH的血栓形成。而最近相关研究报道，PNH细胞通过补体沉积的非钙离子依赖途径释放ErMPs，从而增加血栓形成风险[34]。

综上所述，深静脉血栓形成是一种临床常见病、多发病，近年来我国DVT的发病率呈上升趋势。初诊DVT主要通过患者的临床症状、临床体征、相关辅助检查（如D-二聚体、血管B超）等多个方面综合考虑，但诊断存在一定的滞后性，这将延误治疗的最佳时机并影响患者的预后。如果可以寻找到一种可早期预测DVT的生物标志物，无疑是诊治DVT的福音。目前随着人们对ErMPs的关注不断增加，其在血栓性疾病中的作用不断被发现[8]，如调节血管内皮细胞功能、激活凝血系统及调节炎症反应等。但ErMPs具体的促凝机制及与深静脉血栓形成的关系仍未被阐明，仍需我们进行大量科研研究及临床应用。相信在不久的未来，ErMPs将为深静脉血栓的预防和治疗开拓一个全新的视野。

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