等位基因多重PCR技术快速诊断耐药结核病的应用研究*

甘昭平，梁亚萍,赵 涛,王 卓，李 静，邹远妩

陕西省结核病防治院(西安 710100)

主题词 结核分枝杆菌 结核, 抗多种药物性 广泛耐药结核 @MAS-PCR

耐多药结核病(MDR-TB)和广泛耐药结核病(XDR-TB)的流行和出现是我国结核病控制面临的主要威胁。根据国家基线调查的最新数据，估计每年有120 000个新的耐多药结核病病例和10 000个新的广泛耐多药结核病病例[1]。耐药结核病的流行持续威胁着结核病控制工作已取得的进展，广泛耐药结核病的出现更加剧了这一威胁， 因此，MDR-TB、XDR-TB诊断尤为重要。近年来，随着分子生物学的发展，分子生物学在结核病的诊断中应用越来越广泛，国内外研究人员已开始利用等位基因特异性多重PCR即MAS-PCR技术对结核分枝杆菌进行抗结核药物异烟肼、利福平、氧氟沙星、卡那霉素和卷曲霉素的耐药相关基因突变位点进行检测[2-5]，建立了MAS-PCR技术[5]，用来快速诊断MDR-TB、XDR-TB。本研究利用MAS-PCR技术对108株含MDR-TB、XDR-TB和敏感菌株的结核分枝杆菌临床分离株进行分子耐药检测，并与改良罗氏比例法药敏试验结果进行比较，评价MAS-PCR技术的临床实用价值。

对象与方法

1 研究对象 本研究收集本院2015年8月至2016年8月结核病患者结核分枝杆菌液体快速培养阳性的结核患者108例，其中男72例，女36例，年龄20～78岁，平均年龄(38.5±6.3)岁。对这些患者的108例结核分枝杆菌临床分离株(含MDR-TB，XDR-TB和敏感菌株)，使用MAS-PCR技术进行异烟肼、利福平、氧氟沙星、卡那霉素和卷曲霉素药物敏感试验,并和罗氏固体比例法药敏试验(金标准)进行符合率的比较。

2 方 法

2．1 罗氏比例法药敏试验：采用贝索公司生产的改良罗氏固体药敏培养基行异烟肼、利福平耐药 氧氟沙星，卡那霉素和卷曲霉素药敏实验，试验过程严格按照标准操作规程进行操作[6]。

2.2 MAS-PCR技术方法[7]：采用的外引物序列为：gyraF 5’-TATGCGATGAGCGTGAT-3’；gyraR 5’-GATATTGGTTGCCATGCC-3’,内引物序列为：gyraF1 5’-ACCACCCGCACGGCGATGC-3’；gyraR1 5’-GCCATGCGCACCAGGTTGT-3’，对于内引物序列，在3’端引入了错配碱基(下划线标注)，有效地阻止了错误延伸[8]；反应条件采用降落PCR：95℃预变性5min；95℃ 30s，57℃ 30s，72℃ 40s，5个循环；95℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 40s，5个循环；95℃ 30s，53℃ 30s，72℃ 40s，20个循环，最后72℃延伸3 min。挑选少量有代表性的耐药突变及野生型的菌株为模板，优化反应条件，利用5个不同的反应体系分别检测出结核分支杆菌对五种不同药物的耐药性。试验用的引物由上海生工生物技术服务有限公司合成。

3 质量控制 每批药敏试验均采用结核分枝杆菌标准株H37Rv做质量控制，H37Rv标准株由陕西省结核病防治所结核病实验室提供，标准株对这五种抗结核药均敏感。

结 果

用MAS-PCR检测108株含MDR-TB，XDR-TB和敏感菌株的临床分离株的药物敏感试验，同时采用改良罗氏固体比例法对这些菌株进行药敏试验，以比例法为金标准进行比较，异烟肼耐药的敏感性、特异性、准确性、阳性预测值、阴性预测值分别为75.0%(36/48)、100%(57/57)、86.1%(93/108)、100.0%(36/36)、82.6%(57/69)；利福平耐药的敏感性、特异性、准确性、阳性预测值、阴性预测值分别为76.4%(42/55)、100%(53/53)、88.0%(95/108)、100.0%(42/42)、80.3%(53/66)；卡那霉素耐药的敏感性、特异性、准确性、阳性预测值、阴性预测值分别为100.0%(11/12)、100.0%(96/96)、99.0%(107/108)、100.0%(11/11)、99.0%(96/97)；氧氟沙星耐药的敏感性、特异性、准确性、阳性预测值、阴性预测值分别为75.0%(15/20)、98.9%(87/88)、94.4%(102/108)、93.8%(15/16)、94.6%(87/62)；卷曲霉素耐药的敏感性、特异性、准确性、阳性预测值、阴性预测值分别为77.8%(7/9)、99.0%(98/99)、97.2%(105/108)、87.5%(7/8)、98.0%(98/100)。见表1、表2。

表1 MAS-PCR技术与罗氏比例法药敏方法的比较(例)

表2 MAS-PCR技术药敏方法评价

讨 论

2018年3月24日“世界结核病防治日”的活动主题是“开展终结结核行动，共建共享健康中国”，旨在倡导社会各界力量积极行动起来，采取有效措施，为控制结核病疫情、消除结核病的社会危害，实现健康中国而共同奋斗。而耐药结核病，尤其是MDR-TB和XDR-TB的出现和蔓延，已严重阻碍了这项工作的进程。

由于耐药结核病的诊断复杂，治疗困难，往往疗程很长，耐多药病人一般需要18～24个月，而且医药费用是治疗一般病人的100倍左右，因此耐药结核病的治疗对个人、家庭及社会均造成巨大的经济压力。

大部分MDR-TB和XDR-TB结核病是可以预防的，预防的关键是早期发现病人，并给予规范化治疗，使病人彻底失去传染性。另外，为减少和预防耐药结核菌的传播，建议耐药结核患者尤其是耐多药结核患者早期应住院治疗。但是，对于这些患者再采用标准化疗方案治疗会产生更大的风险，应根据异烟肼、利福平、喹诺酮，卷曲霉素，卡那霉素等主要抗结核药的药物敏感试验结果，进行相应的药物调整，个体化精准治疗，以确保方案中有4种有效或几乎有效的核心药物，这对于控制耐药结核病极为关键。因此快速、敏感、准确的药敏检测不仅是临床选择和评价化疗方案的有效依据，还是重要的流行病学指标，以确保及时和充分地调整耐多药结核病的治疗，尽量减少耐多药结核病的传播，并防止广泛耐药结核病的发展。

但长期以来，我国的结核病实验室通常采用以固体培养基的绝对浓度法或比例法进行药敏检测，这些方法尽管具有简单、经济等优势，但等待的时间比较长需要4周，液体培养的快速药敏检测方法如BACTEC MGIT 960，也需要一周左右才能出结果[9]，还只能做一线抗结核药的药敏试验，而且培养阳性的患者才能做药敏，而培养的阳性率比较低，远不能满足快速发现耐药结核病及临床诊治的需要。近年来，由于分子生物学技术的发展，结核杆菌的耐药机制及其分子基础已基本明了，也相应建立了一些检测结核分枝杆菌耐药相关基因的分子生物学方法，为快速检测耐药结核病和广泛耐药结核病开辟了一条新的途径。本研究的MAS-PCR技术能够检特异性地检测基因的点突变，其原理为在同一个PCR体系中设计两条外引物和一条内引物，内引物的3’端正好对应待检测的突变位点。对于野生型敏感菌株，三条引物均可以起作用，即合成2条PCR产物；而当该位点发生突变时，内引物的扩增的效率就会显著减低，因此只能观察到外引物合成的1条PCR产物。近年来MAS-PCR技术开始用于细菌的耐药检测，该方法能够快速鉴定结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌[10]，还能够检测异烟肼、利福平、氧氟沙星、卡那霉素和卷曲霉素这5种抗结核药物的药敏实验，不仅具有较高的敏感性，特异性，准确性，阳性预测值，阴性预测值，收益较好，还快速、经济、几小时内就可以得到结果，而且仅需要PCR扩增仪、电泳仪等简单的仪器[11]，操作也较为简单，符合临床实验室快速实现对MDR-TB与XDR-TB的检测需求。

作为一种检测方法，MAS - PCR技术检测方法它也有局限性：只能在培养阳性的菌株上评价，而不能直接在痰标本上评价；耐药菌株数量较少，相对分析较少。在以后的研究中应加大耐药菌株数量，最好能够直接在痰标本进行药敏评价。这样就为MDR-TB与XDR-TB的诊断、监测及有效控制提供新技术手段，控制耐药结核病的蔓延，对终结结核病的目标具有促进作用和意义。