固相合成比伐卢定的新方法

157013牡丹江友搏药业有限责任公司

比伐卢定，英文名Bivalirudin，商品名Angiomax，由美国Medicines公司申请，于2000年12月经FDA批转在美国上市，作为一种直接凝血酶抑制剂，它来源于水蛭素衍生物，是一种化学合成的含20个氨基酸的多肽，是凝血酶直接的、特异的、可逆性抑制剂，详细序列为D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH。早期的临床研究显示，比伐卢定抗凝疗效确切，且出血事件的发生率较低，和传统的肝素抗凝治疗相比更为安全，对于接受经皮冠状动脉介入治疗(PCI)的患者，比伐卢定可用于替代肝素，并且随着对比伐卢定临床试验的不断研究，其在别的适应证方面亦表现出了不错的治疗效果，因此比伐卢定的未来应用前景极为广阔[1]。关于比伐卢定的合成方法已有大量文献报道，包括固相合成[2]、液相合成、固液相合成，而多数已报道的固相合成方法采用氨基酸逐个偶联合成，周期长，逐步偶联时树脂反应难以完全，因固相载体选用的不同，主要有TCT树脂及Wang树脂[3-5]，其取代值的限制，总收率较低，同时杂质较多，且随着反应进行，树脂上的肽段变长，对于后上的活性较低的氨基酸，反应困难或不完全。而部分报道虽对上述方法有所改进，在逐个偶联氨基酸中，部分肽段采用一次性接入的制备方法，但对于后续的其他氨基酸接入，对于氨基酸接入反应的难易度及完全度是一样的，不会有改善。本研究采用两个肽片段分别固相合成，每个片段的收率都很高，且接入点选择Gly处，由于其活性强，且空间位阻小，使比伐卢定纯度、总收率也很高，为以后的大量生产提供基础。

材料与仪器

实验材料：Fmoc-甘氨酸、Fmoc-N-三苯甲基-L-天冬酰胺、Fmoc-脯氨酸、Fmoc-2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰-L-精氨酸、Fmoc-亮氨酸、Fmoc-氧叔丁基-酪氨酸、Fmoc-氧叔丁基-谷氨酸、Fmoc-异亮氨酸、Fmoc-氧叔丁基-天冬氨酸、Fmoc-苯丙氨酸、Boc-D-苯丙氨酸、HATU、HOBT、2-氯三苯甲基氯树脂(取代度0.5 mm/g)，均购于希施生物科技(上海)有限公司；CaH2购于西亚试剂；二氯甲烷、哌啶、N,N-二甲基甲酰胺、无水甲醇、冰乙酸均为分析纯(AR)，购于北京化工厂；N,N-二异丙基乙胺为分析纯，购于阿拉丁；三氟乙酸(TFA)为分析纯，购于天津市大茂化学试剂厂；三异丙基硅烷、三氟乙醇均为分析纯，购于北京百灵威科技有限公司；DIC为分析纯，购于西亚试剂。

主要设备：高效液相色谱仪、Waters2996、PAD检测器、Vydac 218TPTM C18柱(5 μm，4.6 mm × 250 mm)、XBridge TM、制备柱C18 OBDTM柱 (10 μm， 30 mm × 250 mm)、 Waters 3100质谱仪、分析天平、BSA2235，产自德国赛多利斯股份有限公司；循环真空泵SHZ-Ⅲ，产自上海亚荣生化仪器厂；旋片式真空泵，2XZ(S)-2，产自上海德英真空照明设备有限公司；旋转蒸发器，RE-52AA，产自上海亚荣生化仪器厂；低温冷却水循环泵，CCA-20，产自巩义市予华仪器有限责任公司；真空干燥箱，BZF-50，产自上海博讯实业有限公司医疗设备厂；高速冷冻离心机，3K15，产自北京五洲东方科技发展有限公司。

方法：⑴树脂载样：2-氯三苯甲基氯树脂(Chemimpex，载样量0.5 mmol/g，2 g)在 40 mL 无水 CH2Cl2中浸泡 30 min，除去溶剂，然后加入首个氨基酸Fmoc-亮氨酸0.7068 g(树脂载样量的2倍)、DIPEA 0.517 g(4倍)、二氯甲烷(40 mL)的溶液，缓慢搅拌1 h，再加入2 mL甲醇继续搅拌15 min。除去溶剂，树脂经二氯甲烷洗涤(20 mL×3次)。取20%哌啶-DMF溶液40 mL加入至⑴所得树脂中，缓慢搅拌15 min以除去Fmoc保护基，然后经DMF(20 mL×3次)洗涤。⑵片段1偶联：将Fmoc-N-三苯甲基-L-天冬酰胺 3.5802 g、 HATU 2.2815 g、DIPEA1.986 mL、DMF(30 mL)混合后形成的溶液加入上述树脂中，缓慢搅拌，然后用DMF(30 mL×3次)洗涤，取20%哌啶-DMF溶液40 mL加入⑴所得树脂中，缓慢搅拌15 min以除去Fmoc保护基，然后用经DMF(30 mL×3次)洗涤。然后顺序接入Fmoc-甘氨酸1.7838 g、Fmoc-甘氨酸1.7838 g、Fmoc-甘氨酸1.7838 g、Fmoc-甘氨酸1.7838 g、Fmoc-脯氨酸2.0244 g、Fmoc-2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰-L-精氨酸3.8928 g、Fmoc-脯氨酸2.0244 g、Boc-D-苯丙氨酸1.5378 g，得到片段1树脂。⑶氨基酸偶联时间通过HPLC检测，首先绘制每一个氨基酸的标准曲线，然后根据检测反应液中未反应完的残留氨基酸浓度，带入标准曲线计算得到反应是否完全，然后确定反应时间，按氨基酸顺序的偶联反应时间如下：①Fmoc-N-三苯甲基-L-天冬酰胺1.5 h；②连续3次Fmoc-甘氨酸分别反应时间0.75 h；③再Fmoc-甘氨酸反应时间1.0 h；④Fmoc-脯氨酸1.5 h；⑤Fmoc-2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰-L-精氨酸2.0 h；⑥Fmoc-脯氨酸1.5 h；⑦Boc-D-苯丙氨酸1.5 h。载有片段1多肽的树脂浸泡于二氯甲烷-三氟乙醇-冰乙酸溶液(8∶1∶1，v/v/v)50 mL中缓慢搅拌1 h混合物抽滤，滤液用水泵30℃水浴减压浓缩，得到侧链保护的粗品肽(片段1)。⑷片段2偶联：按照2.2的方法，依次接入Fmoc-氧叔丁基-酪氨酸1.838 g、Fmoc-氧叔丁基-谷氨酸1.702 g、Fmoc-氧叔丁基-谷氨酸1.702 g、Fmoc-脯氨酸1.3496 g、Fmoc-异亮氨酸1.4136 g、Fmoc-氧叔丁基-谷氨酸1.702 g、Fmoc-氧叔丁基-谷氨酸1.702 g、Fmoc-苯丙氨酸1.5496 g、Fmoc-氧叔丁基-天冬氨酸1.646 g。按氨基酸顺序的偶联反应时间如下：①Fmoc-氧叔丁基-酪氨酸1.0 h；②Fmoc-氧叔丁基-谷氨酸1.5 h；③Fmoc-氧叔丁基-谷氨酸 1.0 h； ④Fmoc-脯氨酸1.5 h；⑤Fmoc-异亮氨酸1.5 h；⑥再两次Fmoc-氧叔丁基-谷氨酸反应时间都是1.0 h；⑦Fmoc-苯丙氨酸1.5 h；⑧Fmoc-氧叔丁基-天冬氨酸1.5 h。⑸比伐卢定合成：片段1溶于50 mL无水DMF中，再加入DIC 0.47 mg、HOBT 0.405 g、干燥的片段2树脂，缓慢搅拌12 h，过滤，树脂经过DMF(20 mL×3次)洗涤，加入切割液三氟乙酸-三异丙基硅-水(95∶2.5∶2.5，v/v/v)40 mL中室温搅拌2 h，过滤，滤液经40℃减压浓缩得到粗品，加入60 mL冷乙醚白色悬浮物，离心后固体减压干燥得到比伐卢定粗品，经过反相制备色谱制备纯化，其纯化方法：以十八烷基键合硅胶为固定相(YMC公司的Triart Prep C18-S)，色谱柱规格为250 mm×30 mm，粒径10 μm，粒空隙12 nm。流动相A：0.1%三氟乙酸水溶液，流动相B：0.1%三氟乙酸乙腈溶液，检测波长210 nm。

结 果

通过片段法合成得到的比伐卢定粗品纯度及收率大大提高，因此制备纯化后的比伐卢定纯度甚至可以达到99.5%，该纯度完全满足国内外注射用比伐卢定的质量要求，粗品的HPLC图，见图1和图2。

图1 比伐卢定粗品HPLC图

图2 纯化后比伐卢定 的HPLC图

讨 论

本研究采用两个肽片段分别固相合成，每个片段的收率都很高，且接入点选择Gly处，由于Gly活性较强，在采用传统的20个氨基酸逐个偶联的过程中，可能会产生2Gly、4Gly杂质的情况，造成最后制备纯化困难，最终导致成品纯度较低。而“10+10”片段法，在Gly处连接，由于其活性强，且空间位阻小，使反应顺利进行，同时不良反应较少，能大大提高收率及纯度。