ICSI操作中增加显微操作皿对妊娠结局的影响

李国臻，耿亚松，杨志伟，陶林林，段新崇，王鑫鑫

(邢台不孕不育专科医院，邢台生殖与遗传专科医院，邢台 054000)

随着辅助生殖技术的成熟，胚胎学家逐渐把目光从提高妊娠率转移到减少多胎妊娠率。减少多胎妊娠率最直接有效的办法就是减少移植胚胎个数[1]，那么如何在减少移植胚胎个数的同时保障高的妊娠率呢？多数研究着眼于胚胎优选和改良操作方式保证移植胚胎的优质化[2-4]。影响ICSI结局的因素中以卵母细胞质量最为重要，因此模拟体内环境以保证卵母细胞培养体系稳态成为各大生殖中心的首选方案[5]。

有研究提出人类IVF实验室中进行配子及胚胎体外操作容易造成温度的改变，温度改变对于卵母细胞纺锤体的损伤是不可逆的，严重影响卵母细胞的质量[6]。而影响ICSI结局的因素中以卵母细胞质量最为重要，卵母细胞纺锤体对于胞体和环境微小的改变都非常敏感[7-8]。因此如何在操作中尽可能减少环境的变化以减少对配子胚胎生长发育潜能的危险因素，成为胚胎学家最关心的话题。

本研究主要探讨ICSI操作过程中两个操作皿对妊娠结局的影响，通过比较实验组与对照组的正常受精率、卵裂率、优质胚胎率、囊胚形成率、种植率、临床妊娠率等，探究ICSI操作的改进方法是否行之有效，以期获得更好的妊娠结局，逐渐减少多胚胎移植增加单胚胎移植比例。

材料与方法

一、研究对象

2016年1月至2017年7月在我中心行ICSI治疗，获卵数>6枚的363个周期；设对照组242个周期，在ICSI操作中应用一个ICSI操作皿，每次注射5枚卵母细胞，操作皿重复使用；实验组121个周期，应用两个ICSI操作皿，每注射5枚卵母细胞更换一次ICSI操作皿(若卵母细胞数小于10枚，每次注射半数的卵母细胞)，替换下来的ICSI皿置37℃培养箱内复温，两个ICSI操作皿交替使用。胚胎培养室为(23±2)℃恒温和40%～60%恒湿的弱光环境。

二、卵母细胞准备

1.促排卵及穿刺取卵

促排卵均使用常规长方案，女方在黄体期肌肉注射促性腺激素释放激素类似物(GnRHa)(达菲林，Ipsen Pharma Biotech，法国)，达到降调目的后，给予重组促卵泡β素(普丽康，Merck Sharp & Dohme Limited，英国)或尿促性素(乐宝得，丽珠制药，珠海)促排卵，定期通过阴道B超监测卵泡发育情况，当1/3卵泡直径≥1.8 cm时肌肉注射人绒毛膜促性腺激素(丽珠制药，珠海)5 000～10 000 U，36.5 h左右B超引导下经阴道穿刺取卵，卵冠丘复合体置于37℃、6% CO2培养箱中培养3～4 h。

2.脱颗粒细胞

至少在取卵后1.5 h，用预热的透明质酸酶消化颗粒细胞，消化时间<60 s，用140 μm孔径剥卵针反复吹打，直至将颗粒细胞完全脱离。

三、精子准备

新鲜精液和冻存精液使用不连续密度梯度离心法或直接洗涤法，附睾和睾丸精子使用直接洗涤法，处理后计数精子密度和活率，放入培养箱中备用。

四、ICSI操作

将卵母细胞和精子分别加入到盖有矿物油(Vitrolife，瑞典)的操作微滴(配子和胚胎处理液，Vitrolife，瑞典)中，应用显微操作系统(Nikon，日本)，用30度角ICSI针(Vitrolife，瑞典)在37℃恒温下选择形态正常、活力好的精子在聚乙烯毗咯烷酮尹汀(polyvinyl pyrrolidone，PVP)(LifeGlobal，美国)中制动并在卵母细胞液滴内行穿刺注射。穿刺时使极体的方向处在6～7点或11～12点的位置，在3点钟的位置注射精子。注射之后的卵母细胞放置在被覆矿物油的约25 μl卵裂培养液微滴(Vitrolife，瑞典)内，胚胎发育第3天转入囊胚培养液(Vitrolife，瑞典)使用抽屉式培养箱(Astec，日本)37℃，6% CO2下培养。

1.受精与胚胎观察

显微注射授精后16～20 h，倒置显微镜(Nikon，日本)下观察卵细胞有两个原核(2PN)为正常受精。

2.根据卵裂球数、碎片、卵裂球大小均一程度对卵裂期胚胎进行评分，优选胚胎原则为：ICSI后68～72 h，6个≤细胞数≤10个，卵裂球大小均匀，形态规则，透明带完整，碎片<20%；D5或D6，采用Gardner[9]评分法进行囊胚评分，优选囊胚原则为：囊胚腔扩张充满整个胚胎，内细胞团细胞密集，滋养层细胞数目多且均匀。

五、胚胎移植及移植后处理

取卵当日肌肉注射黄体酮注射液(浙江仙琚)进行黄体支持。视HCG注射日E2水平，移植日给予适量雌二醇(补佳乐，拜耳医药，德国)补充。在胚胎发育第3天或第5天选择良好胚胎1～3枚移植入子宫，移植当日开始使用黄体酮(安琪坦，博赏医药，法国)口服或阴道上药进行黄体支持。移植后14 d查血HCG确定生化妊娠，移植后28 d B超检查，见孕囊确定临床妊娠。

六、评价指标

正常受精率=正常受精卵数/成熟卵母细胞数×100%；卵裂率=正常受精卵裂数/正常受精卵数×100%；优质胚胎率=优质胚胎/正常受精的卵裂胚胎总数×100%；囊胚形成率=可用囊胚数/养囊胚胚胎总数×100%；种植率=孕囊数/移植胚胎数×100%；临床妊娠率=临床妊娠周期数/总移植周期数×100%。

七、统计学分析

结 果

一、基本资料

2016年1月至2017年7月在我中心行ICSI治疗的363个周期，分为对照组242个周期，实验组121个周期。两组在年龄、不孕年限、体质量指数、基础FSH水平、基础AMH、HCG日激素水平、不孕因素、移植日子宫内膜厚度等方面无显著性差异(P>0.05)(表1)。

表1 两组患者基本情况比较[(-±s)，%(n)]

二、胚胎质量

实验组与对照组的正常受精率、卵裂率和优质胚胎率之间无显著性差异(P均>0.05)；实验组的囊胚形成率显著高于对照组(P<0.05)(表2)。

三、妊娠结局

移植周期中实验组与对照组移植日子宫内膜厚度和新鲜移植胚胎个数无显著性差异(P均>0.05)；实验组的新鲜周期移植种植率比对照组高，但差异无显著性(P>0.05)；实验组的临床妊娠率显著高于对照组(P<0.05)(表 3)。

表2 两组间胚胎质量比较[%(n)]

注：与对照组相比，*P<0.05

表3 两组间新鲜移植妊娠结局比较[(-±s)，%(n)]

注：与对照组相比，*P<0.05

讨 论

ICSI的操作时间随着获卵数的增加而延长，ICSI操作皿在培养箱外的滞留时间也会延长。虽然多数IVF实验室培养箱外的操作主要在含有HEPES/MOPS缓冲体系的培养液中进行，可以有效降低CO2浓度改变带来的pH值变化，但是操作在培养箱外持续暴露，很可能会引起ICSI操作微滴物理和化学的不稳定性[10]。Bavister等[12]认为纺锤体是卵母细胞的一个重要组成部分，在分裂中起着决定细胞极性的作用。纺锤体结构上或功能上的非生理状态会影响细胞分裂期的染色体正常分离和移动，造成细胞分裂错误、染色体单倍体和多倍体的形成、非整倍体胚胎产生、受精卵发育异常和卵裂延迟等[11-12]。人类IVF实验室中进行配子及胚胎操作可能造成温度的改变，卵母细胞纺锤体对于胞体和环境温度的改变非常敏感[13-14]，并且温度改变对于卵母细胞纺锤体的损伤是不可逆的，会严重影响卵母细胞的质量[15-16]，而卵母细胞质量是影响ICSI结局因素中最为重要的因素。因此，温度的改变成为影响配子胚胎生长发育潜能的关键因素。在本研究中使用两个ICSI皿，通过交替使用的方法平衡和稳定操作皿，减弱因培养箱外操作时间过长引起培养体系的改变。结果显示ICSI操作中使用两个操作皿可以显著提高囊胚形成率。推测两个ICSI操作皿的交替平衡使用可能可以通过稳定操作微滴的温度从而减弱因ICSI操作皿中暴露时间过长产生的胚胎发育潜能的危害。

综上所述，本研究通过在ICSI操作中增加操作皿的方法显著提高了囊胚形成率和ICSI新鲜移植周期的临床妊娠率。我们推测培养箱外操作时间过长可能会引起培养体系温度的改变，温度通过影响pH值间接和直接导致卵母细胞纺锤体形成和解聚紊乱可能是影响囊胚形成和ICSI周期临床妊娠率的原因。因此，ICSI操作中通过使用两个操作皿可能可以减弱环境的不稳定因素对于胚胎发育潜能的危害[18-20]，从而可以获得更好的妊娠结局。