miR-214通过MAPK信号通路对非小细胞肺癌放疗敏感性的影响①

靳莉莉 李 静 许东风

(商丘医学高等专科学校护理系,商丘476100)

肺癌是目前人类多种恶性癌症中死亡率最高的主要类型之一[1]。其通过组织学差异主要可以分为小细胞肺癌(Small cell lung cancer，SCLC)和非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)。而非小细胞肺癌又可以进一步分类腺癌、鳞状细胞和大细胞癌[2,3]。在肺癌早期疾病发展阶段，其临床症状不明显，临床检查手段有限，所以大部分晚期发现的非小细胞肺癌患者的预后较差[4]。放射治疗在非小细胞肺癌的不同阶段有不同的作用[5]。针对非小细胞肺癌早期使用放射治疗作为辅助化疗方案，效果仍然需要进行临床观察。而且针对非小细胞肺癌放疗敏感性的研究目前需要深一步的探讨。

非小细胞肺癌的放疗方案通常由铂类化合物组成，例如顺铂，卡铂或奥沙利铂等[6]。而根据目前的临床效果观察，非小细胞肺癌对一线药物治疗的反应效果较差，治疗有效率约10%～15%[7]。而且容易出现耐药及放疗不敏感现象，许多生物学因素被认为是肿瘤内产生细胞性放射抵抗重要原因[8]。部分研究表明在非小细胞癌miRNA的表达模式和相关蛋白信号的表达途径都可能参与到肿瘤细胞放射敏感性的发生机制中[9]。

miRNA是小的内源性非编码单链RNA分子，约由18～25个核苷酸分子组成[10]。他们负责调节靶向mRNA在转录后水平上的表达降解或抑制部分mRNA的翻译过程，从而干扰其相关部分生物性特性[11]。Carroll等[12]学者报告了2 000多种miRNA和已被证实与miRNA可相互调节的肿瘤作用靶标，例如促进细胞增殖和抑制细胞死亡等分子基因。

此外，miRNA还与很多恶性肿瘤细胞的辐射敏感性相关。越来越多的研究指出miRNA可以干扰肿瘤细胞的辐射耐受及敏感性[13]。有研究表明，miR-214能与ATM 相互作用，通过调控下游蛋白的表达水平影响肿瘤细胞的放射敏感性[14]。而且有研究证实，miR-214在非小细胞肺癌组织中的表达明显上调[15]。但miR-214是否参与非小细胞肺癌的放疗敏感性的调节以及具体调节机制，尚无相关研究。本研究通过建立非小细胞肺癌H358放射抵抗细胞株，然后检测miR-214在H358细胞和H358抵抗细胞株中的差异表达，以及抑制miR-214后其细胞活性及对放射敏感性的变化情况，探究miR-214对非小细胞肺癌H358细胞放射敏感性的影响及具体调节机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞株和实验试剂 人肺癌细胞株H358由复旦大学附属肿瘤医院获得。RPMI1640培养基购于美国赛默飞公司，胎牛血清购于杭州四季青生物工程材料有限公司。ERK1、jnk、p38MAPK和γ-H2AX抗体均购买于美国Abcam公司(ab17942，ab176662，ab170009，ab11175)。脂质体Lipofectamine 2000、miR-214-mimic，miR-NC购自(Gnenpharma Co.,Shanghai,China)，CCK-8试剂购买于美国Sigma公司，Trizol购自Ambion(Ambion Inc,Austin,TX,USA)，逆转录试剂盒(FSQ-101)购自日本ToYoBo公司(ToYoBo,FSQ-101,Japan)，PCR试剂盒购自美国Sigma公司(KapaBiosystems Inc,Boston,US)。

1.1.2实验分组 本实验分为3组，空白对照组(Blank组)，阴性对照组(NC组)和实验组(miR-214-mimic组)。空白对照组使用PBS处理，阴性对照组使用miR-NC模拟物处理，实验组使用miR-214-mimic进行处理。

1.2方法

1.2.1qPCR实验 使用miRNA提取试剂盒进行miR-214抽提，实验过程按照试剂盒使用说明进行，抽提之后，使用核酸浓度检测仪检测RNA浓度和纯度，最后将其浓度稀释至50 μg/ml，使用特异性反转录引物进行cDNA合成，反应条件按照cDNA合成试剂盒使用说明进行设置。反应条件：95℃预变性10 min、95℃变性15 s、60℃退火32 s，循环50次后检测其溶解曲线，检测完成后，通过计算机系统自动分析各样本Ct值，然后采用2-ΔΔCt计算miRNA的相对表达量。实验重复3次。miR-214引物序列：5′-CACTCTATATAGTGTATCTTTC-3′(正向)和5′-GGCTTTTAGTGTACGTCGTAATG-3′(反向)。

1.2.2Western blot检测ERK1蛋白的表达 H358-RR细胞转染miR-214-mimic后48 h后提取总蛋白，用BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度，上样60 μg总蛋白，在4%～12%的SDS聚丙烯酰胺凝胶中电泳，用湿转的方式将蛋白转到膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，一抗(ERK1 1∶1 000)4℃摇床孵育过夜，使用TBST洗膜3次，每次10 min，二抗室温孵育2 h，使用TBST洗膜3次，每次10 min，使用超敏ECL化学发光试剂盒显影，使用GAPDH作为内参蛋白。

1.2.3γ-H2AX免疫荧光染色实验 转染miR-214-mimic后的H358-RR细胞，铺板于直径为35 mm 的细胞爬片的培养皿中，培养24 h后接受10 Gy 的X射线照射，照射后均再培养2 h，使用预冷的4%的多聚甲醛在4℃冰箱中固定20 min，使用0.2%的TritonX-100破膜20 min，使用2%BSA 室温封闭1 h，加入50 μl的2%BSA稀释的抗γ-H2AX 小鼠单克隆抗体后，放置于4℃冰箱过夜，加入 50 μl 羊抗鼠FITC二抗，室温孵育1 h。载玻片上加 30 μl 含DAPI的染色液的抗荧光淬灭封片液，室温避光 30 min。然后通过荧光正置显微镜下观测每个细胞核内DNA双链断裂形成的荧光焦点数量，计算每组细胞中的平均荧光焦点数进行统计。实验重复3次。

1.2.4CCK-8检测照射前后的细胞株活力 根据前述实验分组分别取3个组别的对数生长期H358-RR细胞，以每孔3 000个细胞接种于96孔板，每组设3个复孔，以加入PBS作为空白对照，培养24 h后，加入10 μl/孔CCK-8试剂，振匀后避光培养 2 h，酶标仪测其吸光度(A450nm)值；照射组实验细胞进行射线照射10 Gy，继续培养24 h后加入CCK-8 试剂，避光2 h后，使用酶标仪检测各组细胞活力。以空白组的细胞活性值为1.000。实验重复3次。

1.2.5彗星实验检测DNA损伤修复能力 常规接种各组对数期的细胞于6孔板，接种密度为5×105，待细胞贴壁并恢复状态后，给予0 Gy、10 Gy照射，置于细胞培养箱中培养。分别于照射后1 h、6 h收集细胞，胰酶消化、离心后，以1 ml冰冷的PBS重悬细胞，在暗室低温下进行。采用Invitrogen公司的彗星实验试剂盒低溶点琼脂糖LMA沸水浴5 min，完全溶化后置于37℃达20 min，取细胞悬液20 μl与80 μl LMA混匀，置于4℃避光10 min。轻轻加入预冷的新鲜配制的细胞裂解液，4℃裂解过夜。从细胞裂解液中取出并排干载玻片上的水分，置于新鲜配制的DNA解旋液中，4℃避光处理1 h。取出载玻片，轻轻置于电泳槽中，有标记的一侧朝向阴极(黑色)，轻轻倒入电泳液500 ml，恒压21 V，30 min，避光。充分漂洗后染色，每孔加入DAPI工作浓度100 μl，室温避光染色30 min，蒸馏水充分冲洗3次，37℃避光干燥载玻片。 荧光显微镜下观察：每个样本随机拍照100个细胞并保存，用CASP软件分析实验结果。

1.3统计学处理 所有的统计分析均采用SPSS 16.0软件包(SPSS，Chicago，IL)进行。组间比较采用方差分析；应用GraphPadPrism5软件进行统计图形制作。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1人肺癌H358放射抵抗细胞株的建立 体外培养人非小细胞肺癌细胞株H358，待细胞融合度为60%～70%，且细胞生长处于对数生长期时，给予一定剂量的放射线照射。照射后继续于细胞培养箱中培养，密切观察细胞状态。待细胞状态恢复良好后，再进行下一次的照射，重复以上步骤，并逐渐加大每次照射的剂量，直到建立具有稳定耐受放射线能力的非小细胞肺癌细胞株H358(表1)，此时我们命名筛选出的细胞为H358-RR(H358 radiation resistance)，后续试验使用5～10代之间的细胞。

2.2qPCR检测不同组的H358-RR细胞中miR-214的表达水平 通过qPCR实验检测H358和H358-RR中miR-214的表达水平，然后检测miR-214-mimic的转染效率。实验结果显示，相比H358细胞，H358-RR细胞中miR-214的表达水平相对较高，差异具有统计学意义[(1.47±0.14)vs(0.87±0.11)，P<0.05](图1A)。图1B结果显示，转染了miR-214-mimic后，实验组的miR-214表达水平相比NC组和Blank组明显提高[(1.78±0.25)vs(0.62±0.12)vs(0.53±0.08)，P<0.05]，差异具有统计学意义。表明miR-214-mimic转染效率良好，可以有效提高H358-RR细胞中miR-214的表达。

2.3Western blot检测不同组肺癌细胞中ERK1蛋白的表达水平 通过Western blot实验检测H358-RR不同处理组细胞中ERK1蛋白的表达水平。实验结果显示(图2)：转染了miR-214-mimic后，ERK1、jnk和p38MAPK蛋白的表达水平相比NC组和Blank组均明显提高[(1.38±0.22)vs(0.25±0.07)vs(0.27±0.12)，P<0.05；(1.35±0.15)vs(0.23±0.09)vs(0.22±0.05)，P<0.05；(1.19±0.11)vs(0.28±0.08)vs(0.26±0.06)，P<0.05]，差异具有统计学意义。表明miR-214可以调控下游ERK1、jnk和p38MAPK蛋白的表达，提高ERK1、jnk和p38MAPK的表达水平，激活相应的MAPK信号通路。

2.4miR-214的表达对肺癌H358细胞对放疗敏感性的影响(γ-H2AX表达) 为进一步观察在电离辐射处理后细胞变化，通过免疫荧光检测γ-H2AX聚集点不同处理的H358-RR细胞株中的表达水平。实验结果显示，γ-H2AX蛋白在对照组(NC)和空白组(Blank)中的表达较明显，在实验组(miR-214-mimic)中的表达明显降低，电离辐射明显促进了γ-H2AX聚集点的形成，在过表达miR-214之后，γ-H2AX聚集点的表达明显较少，DNA损伤较少(图3)。

表1肺癌H358放射抵抗细胞的建立方法

Tab.1MethodforestablishinglungcancerH358radiationresistantcells

RadiationIradiation dose and frequency2 Gy4 Gy6 Gy8 Gy10 GyTotalDoseTimeX ray2222260 Gy3 min

图1 qPCR检测肺癌细胞中miR-214的表达水平Fig.1 Detection of miR-214 expression in lung cancer cells by qPCRNote: *.P<0.05.

图2 Western blot检测肺癌细胞中ERK1蛋白的表达水平Fig.2 Western blot detection of lung cancer cells in expression of ERK1 protein levels

图3 免疫荧光技术检测γ-H2AX聚焦点在电离辐射之后的变化情况Fig.3 Immunofluorescence technique to detect changes in gamma-H2AX focal point after ionizing radiation

2.5放射线照射对不同处理的肺癌细胞活力的影响 通过CCK-8细胞实验检测不同组的肺癌细胞在接受放射前后细胞活力的情况。结果显示，未接受放射时，相比Blank组和NC组，miR-214-mimic组细胞活力变化轻度降低，而Blank组和NC组之间差距不明显，无明显地统计学意义。在接受10 Gy放射线之后，miR-214-mimic组的细胞活力相比NC组和Blank组降低幅度小，差距具有统计学意义(P<0.05)，表2。表明过表达miR-214后可以有效减少细胞凋亡，减少细胞活力的下降，对放射损伤有一定的抵抗性。

表2放射线照射对各组肺癌细胞活性的影响

Tab.2Effectofradiationonactivityoflungcancercellsineachgroup

IrradiationdosenBlank groupNC groupmiR-214-mimic groupP0 Gy51.000±0.0001.256±0.0320.896±0.0820.05810 Gy50.256±0.0080.392±0.0240.752±0.0390.008

图4 电离辐射诱导H358-RR细胞DNA损伤产生的情况Fig.4 Generation of DNA damage induced by ionizing radiation in H358-RR cells

2.6单细胞凝胶电泳检测放射线照射后不同组肺癌细胞DNA损伤情况 H358-RR细胞转染miR-214-mimic后，分为两组，NC组和分别于10 Gy照射后1 h、6 h收集细胞进行彗星实验，结果如图4所示，照射1 h后，两组细胞核明显形成彗星尾，呈现出彗星头大，彗星尾细长的特殊征象，而照射6 h后，两组细胞的彗星尾明显缩短，说明NC组和miR-214-mimic组细胞均有一定程度的修复能力，但是在照射后1 h及6 h，miR-214-mimic组细胞的尾距明显短于NC组细胞，说明miR-214-mimic组细胞的抵抗放射线及对DNA损伤修复的能力均强于NC组细胞。

3 讨论

miR-214是近年来研究较火热的一种小分子miRNA。田延锋等[16]报道成熟miR-214分子长度为22个核苷酸，在多种肿瘤组织中存在异常表达。已有研究表明，miR-214在多种肿瘤组织中表达下调，影响肿瘤细胞的增殖、凋亡、转移等过程，并可能参与调控肿瘤细胞对放射线辐射的敏感性[17,18]。Zhong等[19]以肺癌A549为研究对象，发现miR-107在肺癌A549细胞系中表达明显上调，通过体外转染miR-107类似物的方法使过表达miR-107的表达水平之后发现，miR-107能抑制下游stathmin1蛋白表达水平，进而干扰肺A549癌细胞对的放射线的敏感性。而Liao等[20]研究发现，在肝癌细胞中上调miR-214 的表达水平，可以与APK相互作用，通过抑制相关蛋白的表达起到抑制肝癌细胞的放射敏感性。

最近很多研究已经显示了miRNA表达在多种恶性肿瘤中都有相应的监管机制，包括肺癌、肝癌、结肠癌，神经胶质瘤等等[21-23]。其中某些miRNA已经被广泛认为是关键的致癌基因或抑癌基因[24]。而目前恶性肿瘤的治疗方案中，放射治疗是常见的治疗方案之一，尤其是针对非小细胞肺癌，放射治疗是出现播散和转移后的有效首选方案，但是其对放射剂量的耐受和敏感性降低是目前临床上存在的主要问题[25]。曾有学者研究指出部分miRNA在恶性肿瘤的放射治疗过程中，对肿瘤细胞的放疗敏感反应有一定的调控作用[26]。然而，目前尚没有关于miR-214在肺癌细胞中的表达和与放射治疗相关性的研究。因此，我们在肺癌类型中选取了非小细胞肺癌细胞株进行miRNA分析和放疗敏感性的研究。

在电离辐射引起的损伤中，对肿瘤细胞最为致命的是DNA DSBs损伤，未修复的DNA双链断裂数量增加表明细胞的存活率减少，即辐射敏感性提高，故DSBs 是与辐射敏感性密切相关的重要指标[27]，而磷酸化的H2AX(γ-H2AX)与DSBs是等量关系，所以检测γ-H2AX也是测量DNA损伤的重要方式[28]。本研究也是通过应用免疫荧光法检测了不同处理的H358细胞的荧光焦点数来判断其DNA损伤情况，表明miR-214是通过阻止DNA损伤修复来提高H358细胞的放疗敏感性。

我们首先构建了非小细胞肺癌的放射抗性细胞株H358-RR，前述相关实验检测放射抗性细胞株H358-RR对放射线敏感程度的稳定抵抗，且影响细胞株的增殖和侵袭等恶性行为[29]。然后检测H358-RR细胞株中的miR-218和ERK1的表达水平，探讨miR-214-mimic对H358-RR细胞株中miR-214和ERK1的调控作用，及对MAPK信号通路的激活情况。我们的研究分析显示，过表达miR-214后，γ-H2AX的聚集点显著减少，表明DNA损伤相对较少，过表达miR-214可以有效抵抗放射作用，产生放射耐受，降低肺癌细胞株的放射敏感性。另外单细胞凝胶电泳又称为彗星实验，是检测DNA损伤常用的技术之一，也可以通过检测DNA链的损伤程度来判断DNA损伤的修复能力。本实验通过单细胞凝胶电泳实验证实了过表达miR-214后，DNA损伤修复能力得到增强，对放射线的抵抗性强于NC组细胞。表明miR-214的表达在一定程度上可以减弱肺癌细胞的放射敏感性，增强其放射抗性，一定程度上削弱放射强度对肿瘤细胞的损伤能力。在这种情况下，miR-214并没有介导细胞凋亡信号的传导，而仅仅是通过增加miR-214的表达削弱其对放射的敏感性。

而我们通过检测miR-214对MAPK信号通路中ERK1蛋白表达水平影响发现，miR-214可以调控ERK1蛋白的表达， 两者呈正相关关系，证实了miR-214在肺癌细胞中的过表达可以相应增加ERK1的表达。曾有研究指出miR-214可以激活MAPK信号通路对肺癌细胞的生物学行为进行干扰，甚至抑制其侵袭和转移过程[30]。所以我们推测miR-214可以通过调控MAPK信号通路对非小细胞肺癌的放疗敏感性进行干扰调控。通过对非小细胞肺癌活力的检测同时也验证了miR-214可以影响非小细胞肺癌对放射疗法的敏感度。

总而言之，本实验通过分析非小细胞肺癌中的miR-214的表达水平，及其表达对H358细胞的活性及放射敏感性的影响，逐步证实了miR-214对肺癌细胞放射抵抗的功能性作用及其可能作用机制，当然，本实验也存在一定的实验缺陷，未在动物体内进行试验验证放射强度对体内肿瘤细胞的影响，拟后续实验逐步完善相关研究。所以，本实验首次在体外实验中明确了过表达miR-214可以减弱非小细胞肺癌细胞H358的放射敏感性，并且对其可能作用机制做了初步的探讨。对提高非小细胞肺癌临床放疗效果，发展新的肺癌治疗手段提供了一定的实验依据。