不同菜豆壳球孢菌株对芝麻茎秆和叶片的致病力

赵新贝，刘新涛，倪云霞，赵 辉，王 婧，王 丽，刘红彦*

(1.河南省农业科学院 植物保护研究所，河南 郑州 450002； 2.西北农林科技大学 植物保护学院，陕西 杨凌 712100； 3.河南省植物保护植物检疫站，河南 郑州 450002)

茎点枯病又称为茎腐病、炭腐病，是芝麻生长期内主要的真菌病害之一[1-5]。该病由菜豆壳球孢[Macrophominaphaseolina(Maubl.)Ashby]侵染所致[6-7]。菜豆壳球孢是世界性分布的土传[8]和种传[9]病原真菌，可侵染芝麻、花生、豆类、烟草、棉花、番茄等500多种植物[10-11]，引起植物炭腐、根腐、茎腐、果腐、叶斑等病害[12]。该病原菌在芝麻上危害，不仅造成芝麻减产，同时使芝麻品质下降，含油量降低[4,13]。虽然壳球孢属只有菜豆壳球孢1个种[14]，但不同菜豆壳球孢菌株在培养形态、致病力和分子水平上存在显著差异，这些差异是划分菜豆壳球孢亚种的依据[15-16]。目前对不同地区和不同寄主上分离的菜豆壳球孢致病力差异的研究较多。Prasad等[17]报道了南印度的菜豆壳球孢菌株在形态、致病力和基因组成上都有明显差异；Sexton等[18]研究发现，采自美国北部的菜豆壳球孢菌株对美国南部温室内黄豆的毒力，比南部采集的菜豆壳球孢菌株毒力更强；Salunkhe等[19]的研究表明，采自印度马哈拉施特拉邦3个不同地区的菜豆壳球孢菌株，在菌落形态、生长速率、菌核形成和毒力上都有很大差异；Rayatpanah等[20]发现，从向日葵、黄豆和芝麻上分离的24株菜豆壳球孢对向日葵和芝麻的致病力差异明显。对不同芝麻种植区菜豆壳球孢致病力的研究，有助于茎点枯病区域性防治措施的制定。田间调查发现，该病原菌多从根系侵染，向上蔓延，呈现根腐、茎腐，但也发现部分地区的菜豆壳球孢可同时侵染芝麻的根茎和叶片，致使芝麻出现根腐、茎腐和叶斑并发的症状。有关菜豆壳球孢菌株对芝麻茎秆和叶片致病力的研究鲜见报道，本研究从我国芝麻产区采集分离的茎点枯病原菌中，选取了8株菜豆壳球孢菌株，接种豫芝4号和商水农家种，以期明确不同茎点枯病原菌对芝麻茎秆和叶片的致病力差异。

1 材料和方法

1.1 培养基

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：去皮马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂18 g、蒸馏水1 000 mL，121 ℃灭菌30 min。PDA不加琼脂即为PD培养基。

1.2 芝麻品种

选用茎点枯病感病品种豫芝4号和高抗品种商水农家种[21]。

1.3 供试病原菌

8株菜豆壳球孢菌株分别于2010年、2013年和2014年采集，由河南省农业科学院植物保护研究所生防实验室分离、纯化和保存。采集信息见表1。

表1 参试的菜豆壳球孢菌株

1.4 OA培养基上菌核和分生孢子器观察

将活化后的菜豆壳球孢菌株，接种到铺有玻璃纸的OA培养基上，28 ℃黑暗倒置培养24 h后，置于距离黑光灯20 cm处培养4 d，镜检观察是否产生菌核和分生孢子器。

1.5 叶片接种菌源制备

挑取冻存管中保存的菜豆壳球孢菌株，接种到PDA平板上，28 ℃培养3 d，挑取菌落边缘菌丝块，转接到新的PDA平板上，培养5 d，作为叶片接种菌源，并观察记录菌落形态特征。

1.6 茎秆接种菌源制备

牙签在蒸馏水中煮沸15 min后，浸泡1 h，再用蒸馏水煮15 min，弃蒸馏水，用PD培养基煮30 min后捞出控干，置于90 mm的培养皿中，121 ℃灭菌30 min，备用。

将病原菌接种到PDA平板上，28 ℃光照培养3 d，待菌丝长满平皿后，每皿放置18支处理过的牙签，28 ℃光照培养5 d，用带菌牙签接种芝麻茎秆。

1.7 叶片接种

在豫芝4号芝麻初花期进行盆栽叶片接种试验。选取芝麻中部叶片，在叶片中间接种菌饼(直径6 mm)，用透明胶带固定及保湿，以无菌PDA为对照(CK)。分别于8:00和18:00喷雾保湿。每菌株接种1盆，每盆4株，每株接种4片叶。完全发病后，按照 十字交叉法测量病斑直径[22]，计算病斑的平均直径，并依据病斑直径评价菌株致病力。

1.8 茎秆接种

在豫芝4号和商水农家种初花期进行茎秆穿刺接种。选择距芝麻茎秆顶端1/4处的幼嫩部分进行穿刺接种，每菌株接种1盆，每盆4株，以无菌牙签作为对照(CK)。接种6 d时，测量病斑长度，并截取发病组织，刮取表面，在显微镜下观察产生菌核和分生孢子器的情况。

2 结果与分析

2.1 菜豆壳球孢菌株的培养特征

菜豆壳球孢在PDA培养基上生长迅速，培养3 d可长满培养皿；气生菌丝致密，分布均匀，初为白色，后期颜色差异较大，从灰白、灰色到黑色(图1)。8个菌株在PDA上均不产生分生孢子器，除了菌株2013-037，其余7个菌株均产生丰富的菌核。

综上所述，Notch、Wnt信号通路对OA的影响主要表现在，对干细胞的成软骨及成骨分化、软骨细胞的增殖及肥大化、MMPs的合成、破骨细胞的增殖及分化等过程的调节。而这些信号通路又受到相关因子、激素、机械压力等影响。在查阅文献过程中可以发现，通过调节脂代谢、温补肾阳、调节软骨压力等治疗OA的新思路已初见雏形。OA中与软骨细胞增殖相关信号通路并未完全发现，一些非经典途径的研究涉及较少，且许多机制还未完全阐明。因此，基于这些信号通路对OA的影响，利用调控信号的手段，相信可以为OA的研究及治疗提供新的思路。

图1 菜豆壳球孢菌株在PDA培养基上的培养特征

2.2 菜豆壳球孢菌株对叶片的致病力

将菜豆壳球孢菌株接种豫芝4号芝麻叶片，菌株2013-037最早在接种叶片后25 h产生褐色病斑，接种后3 d，病斑已沿主叶脉扩展至整叶，后期叶片萎蔫，干枯脱落，该菌株致病力最强；菌株2013-006致病力相对较弱，叶片在接种后49 h显症，接种8 d时，最长病斑直径占叶片长度的3/4；接种后8 d，在其他菌株接种的叶片上，仅可观察到直径0.01～0.47 cm的过敏性坏死斑(表2)，说明其对叶片的致病力很弱。

表2 菜豆壳球孢菌株在芝麻叶片上的显症时间及病斑直径

注：数据后不同小写字母表示在P=0.05水平差异显著，下同。

2.3 菜豆壳球孢对茎秆的致病力

从表3可以看出，在豫芝4号芝麻茎秆上，供试菌株均能迅速侵染，接种后25 h，除2010-028c外均可显症；菌株2010-028a致病力最强，病斑扩展迅速，平均每日扩展3.55 cm，2013-037致病力次之；菌株2013-005对豫芝4号的致病力最弱，在茎秆上的病斑长度显著小于其他菌株。在商水农家种芝麻茎秆上，仅4株菌在接种后25 h显症；菌株2013-058与2010-028a致病力最强，2013-037次之，其他菌株致病力显著低于2013-058，其中菌株2013-005的致病力最弱。不同菌株在2种芝麻品种上侵染发病程度的变化趋势一致，但在豫芝4号茎秆上，病害的发生程度明显重于商水农家种，表明商水农家种对茎点枯病的抗性水平高于豫芝4号。

表3 菜豆壳球孢菌株在芝麻茎秆上的显症时间及病斑长度

2.4 OA培养基和芝麻茎秆上的菌核和分生孢子器观察结果

供试菌株在诱导产孢培养基和芝麻茎秆上，产生菌核和分生孢子器的情况存在差异，且在芝麻茎秆上产生菌核和分生孢子器的量也有明显不同(表4)。在OA培养基上，菌株2013-037既不产生菌核，也不产生分生孢子器；菌株2013-005和2013-006产生菌核，不产生分生孢子器；其他菌株均可产生菌核和分生孢子器。而在豫芝4号的茎秆上，依据产生菌核和分生孢子器的多少，可分为4种情况：2013-037和2010-028a产生菌核和分生孢子器的量相当；2013-006、2013-058和2014-034产生菌核较多；2010-010和2010-028c产生分生孢子器较多；2013-005既不产生菌核，也不产生分生孢子器。

表4 菜豆壳球孢菌核和分生孢子器的产生情况

注：OA上“-”表示未观察到菌核或分生孢子器，“+”表示观察到菌核或分生孢子器。茎秆上“-”表示未观察到菌核或分生孢子器，“+”表示观察到少量菌核或分生孢子器，“++”表示观察到中等量菌核或分生孢子器，“+++”表示观察到大量菌核或分生孢子器。

3 结论与讨论

不同地理来源的菜豆壳球孢菌株，其形态特征、菌核和分生孢子器产生数量以及致病力均存在差异。Ashraf等[23]从巴基斯坦旁遮普省4个地区的玉米上分离到了24株菜豆壳球孢菌株，这些菌株菌丝的径向生长、菌核大小、菌核数量和致病力都明显不同。本试验以我国芝麻主产区采集分离的8株菜豆壳球孢菌株为材料，分别研究其形态特征、在成株期芝麻叶片和茎秆上以及不同芝麻品种上的致病力差异。结果表明，这些菜豆壳球孢在PDA上的菌落形态和颜色不同，且不同菜豆壳球孢菌株对叶片和茎秆的致病力存在差异，2013-037和2013-006既可使叶片发病，也可使茎秆发病，而其他菌株只能使茎秆发病，在叶片上仅产生过敏性坏死反应。从豫芝4号与商水农家种茎秆上的发病情况看，不同菌株在2种芝麻品种上侵染后，发病程度的趋势一致，但是同一菌株在豫芝4号上的致病力更强，同时也表明芝麻品种间抗病性有明显的差异，商水农家种表现出更高的抗病水平。

比较不同菌株在诱导培养基OA和芝麻茎秆上产生分生孢子器的情况发现，在茎秆上分生孢子器更易产生，且在诱导培养基上能否产生分生孢子器，与菌株致病力强弱无关。Salunkhe等[19]研究表明，产生菌核少的菌株毒力小，而产生大量菌核的菌株毒力强，通过对豫芝4号芝麻茎秆上产生菌核的情况与致病力情况比较，发现除了菌株2010-028a，其他菌株确实表现为菌核产量与致病力呈正相关。

菜豆壳球孢主要以菌核在种子、土壤和病残体上越冬，菌核是次年侵染的主要菌源，而分生孢子主要在芝麻生长后期借风雨传播进行再侵染，使田间病害迅速蔓延[24]。病害的发生程度取决于病原菌的数量、致病力强弱、寄主抗性水平和气候因素，明确菜豆壳球孢菌株是否产生菌核和分生孢子器，以及对叶片和茎秆的致病力差异，对合理制定芝麻茎点枯病防治措施具有重要的指导意义。在该病的防控上，首先要选用抗病品种，应加强对芝麻产区菜豆壳球孢菌株产生菌核和分生孢子特性及其致病特性的监测，依据当地芝麻品种的抗性水平、病原菌的生物学特性和致病力，制定针对性的防控措施。若当地缺乏抗病品种，菌株能产生大量菌核，则应采用药剂拌种或土壤处理，以及苗期喷淋杀菌剂，抑制病原菌初侵染，保护芝麻根系；对于侵染芝麻茎秆能力强且产生大量分生孢子器的菌株，则应在芝麻花蒴期及时喷洒杀菌剂，阻止病菌扩散，预防病害的大面积发生。依据菌株对芝麻根茎和叶片的致病特性，对于侵染根茎的菌株，以根茎保护为主，对于能同时侵染根茎和叶片的菌株，还应在芝麻封顶前后喷洒杀菌剂，加强对叶片的保护，预防叶病发生。