水产源抗冻蛋白构效关系及在食品加工储藏中应用的研究进展

2018-12-07 12:19,,,,,,,*
食品工业科技 2018年22期
关键词:冰晶抗冻面团

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(1.渤海大学食品科学与工程学院,生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心,辽宁锦州 121013;2.萧山出入境检验检疫局,浙江杭州 311208;3.浙江工商大学食品与生物工程学院,浙江杭州 310018;4.中国计量大学生命科学学院,浙江杭州 310018;5.中国海洋大学食品科学与工程学院,山东青岛 266100)

抗冻蛋白(antifreeze proteins,AFPs)最早是由Devries于1969年在南极海鱼(TrematomasBorchgrevinki)的血液中提取而来[1],是一类有效预防低温环境下生物体内冰晶生长而损伤细胞,提高生物抗冻能力的蛋白质类化合物总称[2]。这类蛋白质与Prism型晶面紧密结合,产生抗冻活性,降低冰晶的冰点,造成冰点与熔点之间出现温度差,该差值被称为热滞活性(thermal hysteresis activity,THA),抗冻活性可用热滞值表示,热滞值越大其抗冻活性越强。因而抗冻蛋白又称为热滞蛋白(thermal hysteresis protein,THPs)、冰结合蛋白(ice binding proteins,IBPs)或冰结构蛋白(ice structuring proteins,ISPs)[3]。抗冻蛋白由于其特殊的热滞效应已被广泛地应用在食品加工储藏运输、医学细胞器官的超低温保存以及相关农业和工业等领域[4]。目前,国内外关于抗冻蛋白的研究主要集中在鱼类、昆虫、植物、细菌及真菌上[5],尤其近年来植物源抗冻蛋白在食品中的应用逐渐增多,鱼源抗冻蛋白的研究虽已较为深入,但其它水产生物源抗冻蛋白的研究甚少。

本文将着重就水产源(鱼、虾、贝及其它水产生物)抗冻蛋白的构效关系及其在食品加工储藏中的应用进行综述,旨在对水产源抗冻蛋白结构与功能的关系进行深入探讨,为今后研究抗冻蛋白源的更多生物种类、更为有效地利用抗冻蛋白及扩大生产应用提供一定的理论借鉴。

1 水产源抗冻蛋白的构效关系

1.1 鱼源抗冻蛋白(Antifreeze protein,AFP)

鱼类AFP是迄今为止研究最为广泛和透彻的一类蛋白,按照氨基酸序列和蛋白质结构的不同,可分为六类:Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型、抗冻糖蛋白(antifreeze glycoprotein,AFGP)和高活性抗冻蛋白(hyperactive antifreeze protein,HAFP)[2]。纪瑞庆等[6]对鱼源六种AFP结构和抗冻活性间的关系做了详细的综述。表1总结了六种鱼类AFP的相对分子质量、热滞活性、氨基酸序列、二级结构特征、三维结构图形、同源蛋白、Protein data bank(PDB)ID、代表性物种。由表1中可以看出,不同抗冻蛋白的热滞活性不同,且热滞值越高,其抗冻活性越高。鉴于其独特的功能,AFP可以提升细胞在冰冻胁迫下抗结冰能力,减缓小冰晶相互结合的速率,修饰冰晶形态,抑制反复冻融造成的重结晶现象,降低过冷却点,保护细胞膜。使生物体具有抗寒能力和抗冻的作用,避免了低温对生物造成不可修复的伤害,还可调节原生质体过于寒冷状态。

表1 鱼源抗冻蛋白的结构和特征Table 1 Structure and characteristics of antifreeze proteins from fish species

1.2 虾、贝源AFP构效关系

迄今为止,虾、贝源AFP的研究较少,刘志东等[20]及马庆保等[21]以南极磷虾(Euphausiasuperba)为原料,以AFP得率为指标,采用特异性亲和吸附法提取南极磷虾AFP,差示扫描量热法(differential scanning calorimetry,DSC)评价南极磷虾AFP的热滞活性。结果表明,南极磷虾AFP的预测得率为30.12%,分子量约为76 kDa,THA为1.76 ℃。研究发现[13],AFP的冰晶结合位点是相对疏水的,将AFP溶解于水中,其冰晶结合位点可能无法完全展开,活性受到抑制,造成THA的下降。因此,可将AFP溶于低盐溶液以提高抗冻活性。Carvajal-Rondanelli等[22]从蓝贻贝(Mytilus edulis)中提取到AFGP,经研究它是由三肽单元[-Ala-Ala-Thr(双糖基)-]重复串联而成的糖蛋白,研究表明,糖基经过乙酰化和过氧化等化学处理后,该AFGP表现为无抗冻活性,因此认为糖基是抗冻活性形成的主要基团。其在溶液中以反平行左手α-螺旋存在,其中疏水基团面向碳骨架,而亲水基团面向溶液。研究表明,其抑制冰晶结晶的机理为:溶液中的亲水基团和小分子形成氢键,阻止了冰核的形成,并且它们的抗冻活性与AFP相对分子量成正相关[4]。

1.3 其它水产生物AFP构效关系

目前,国内外对其它水产生物,如水产无脊椎动物和海藻等水产生物中AFP的研究尚少。Wilkins等[23]首次报道了海洋无脊椎动物海绵(Hamaxinellabalfourensis)的亲水提取液在水的晶体形态上表现出非依数性降低冰点的作用。利用反相高压液相色谱法对提取液进行纯化,用基质辅助激光解吸电离质谱法和氨基酸测序鉴定结构分离出主要肽,并对其进行测定,结果表明该物质具有较强的非平衡抗冻活性,相对分子量为2.5 kDa,此类蛋白可能为一种新型的AFP。2009年,Raymond等[24]对南极雪藻拟衣藻进行了研究,一共分析了1300个表达序列标记(expression sequence tag,EST),发现南极雪藻体内存在抗冻活性的功能基因。王兴娜[25]研究发现南极冰藻因具有独特的抗冻基因调节机制,使其可以生存于寒冷、干燥、高盐、强福射的极地海冰气候环境。该课题组利用实时定量PCR研究了16种基因在冷冻胁迫条件下的表达变化,并对其中一条抗冻蛋白基因进行了异源表达,深入研究其功能。将AFP基因成功转化到大肠杆菌并成功表达,发现大部分AFP以包涵体形式存在,并显著提高了大肠杆菌的抗冻能力。又进一步将AFP转入莱茵衣藻中,发现部分重组藻株的抗冻活性略有增强。Raymond等[26]还在南极绿藻、雪藻、衣藻、苔藓和蓝藻中提取出具有抑制冰重结晶半纯品的冰活性物质,对该物质进行加热处理,其抑制冰晶重结晶的能力降低。因此,推测该物质可能为某种AFP,通过与冰特定结合而抑制冰重结晶。其中衣藻AFP能特异性地同时结合到冰晶的棱面和基面,使冰晶沿a轴生长,结果使冰晶呈盘状,其抗冻活性更高,被称为高活性抗冻蛋白[4]。由此表明,不同来源的AFP结构有明显区别,但是其抗冻机制主要是通过与冰特定的结合作用而实现的。

2 AFP在食品加工储藏中的应用

2.1 AFP在水产品中的应用

2.1.1 AFP在转基因水产品加工中的应用 由于天然提取的AFP含量较低,利用转基因技术人工合成AFP已在很多领域实行。Fletcher等[27]首次将美洲拟鲽(Pseudopleuronectesamericanus)血淋巴AFPⅠ直接注入虹鳟鱼(Salmogairdneri)体内,结果显示虹鳟鱼产生抗冻活性,且AFP没有受体种属特异性。之后我国研究人员利用AFP转基因技术提高水产生物的耐低温性,并对此做了许多研究。如,李卫东等[28]构建了美洲大绵鳚(Macrozoarcesamericanus)中的一种AFP Ⅲ(HPLC-12)表达基因载体,并借此载体通过转基因的方法快速培育南方重要经济贝类—杂色鲍耐低温新品种,研究结果表明HPLC-12抑制冰晶重结晶活性最高,此亚型在酵母细胞中表达后,产生亚基单体蛋白,这种单体蛋白相对于其他的二聚体或多聚体AFP具有明显的优越性,不需要蛋白酶或其它化学物质的催化即可直接产生抗冻活性。杨敏等[29]将从南极鱼绵鳚科中提取的多聚AFP Ⅲ基因克隆得到AFP Ⅲ的四聚体,并构建真核表达质粒,筛选获得稳定表达的细胞系,将其转到斑马鱼细胞系中,发现AFP Ⅲ的四聚体基因可以在斑马鱼细胞系中大量表达,并且能够能显著增强细胞的抗寒能力,减少斑马鱼细胞在低温胁迫下的死亡率。利用AFP进行水产生物转基因技术成功的案列还有:将抗冻蛋白通过基因工程技术应用在不耐寒的水产经济动物罗非鱼体内,使其具有抗寒性,不仅延长了罗非鱼的生长期,还扩大了养殖范围,提高了产量[4]。由于低温对水产生物的影响限制了养殖业的发展,然而抗冻蛋白的发现和生物技术的发展为水产养殖业提供了广阔的发展前景。另外,转AFP基因的水产品还有遮目鱼、鲑鱼、鲮鱼、金鱼及罗氏沼虾等。这些耐低温的水产新品种不仅对促进水生经济动物转基因育种工作的开展具有重要意义,而且可以改变当前的养殖范围,降低生产成本,提高经济效益[5]。因此,将AFP应用在转基因水产品加工领域具有重要的意义。

2.1.2 AFP在水产品冻结或冻藏中的应用 低温冷链物流是水产品生产、运输过程中不可或缺的环节,在此期间,水产品会经历解冻、冻结、解冻等循环反复冻融过程,其内部水分子会经历冰晶形成和重结晶等现象,导致细胞汁液流失,体液局部浓缩,细胞组分变化和蛋白质变性。这些现象会严重降低水产品品质[30]。在水产品冷冻加工和储藏时,冷冻的温度及速度会引起冷冻产品的组成成分及产品质量发生变化。如冷冻鱼糜冷冻过程中,食品内部水分子会产生冰晶,若冷冻速度过慢,造成冰晶过大,蛋白质变性,食品营养价值降低[4]。但是,在冻结或冻藏水产品中添加AFP,可以有效降低解冻水产品的汁液流失率,蛋白质氧化、变性及聚集程度,提高冷冻制品的品质。

谭昭仪等[31]研究了在24周的冻藏周期内,添加新型AFP对鳙鱼鱼糜凝胶强度及蛋白质冷冻变性的影响。结果表明,在鱼糜冻藏前添加AFP,可以抑制盐溶性蛋白在冻藏过程中的变性,保持鱼糜良好的凝胶特性。Ohta等[32]研究发现,向冻藏的鱼肉中添加脯氨酸可以抑制Ca2+-ATPase活性的降低,提高冷冻鱼肉的保水性。这可能是因为脯氨酸使得包埋在蛋白质结构中的AFP基团被释放出来,提高冷冻品的耐储藏能力,防止其冷冻变性,改善产品品质。宋丽丽等[33]研究了12% NaCl和0.2 mol/L AFP混合抗冻液浸渍,对不同冻藏温度下的斑点叉尾鮰鱼片解冻后品质和蛋白质变性的影响。结果表明,由于AFP具有非依数性的降低冰点,抑制冰晶生长速度的特性,添加AFP可以降低解冻鮰鱼片的pH,减少解冻后水分流失,维持较低的K值和挥发性盐基氮含量,缓解脂肪氧化,保持较高的盐溶蛋白含量和Ca2+-ATP酶活性。因此,AFP可有效保持解冻鮰鱼片较好的品质,减轻解冻鮰鱼片蛋白质冷冻变性的程度。另外,还可以将AFP通过直接混合、浸泡、真空渗透或制备抗冻液等方法,应用于水产品的冷冻及解冻加工过程中,使内部水分子形成均匀的小冰晶,抑制重结晶,减少细胞损伤以及防止蛋白质变性而引起的肉质持水能力下降,改善水产品在解冻过程中常出现的汁液流汁、软烂等问题,提高水产品质量[4]。

2.2 AFP在肉制品中的应用

丰富多样的加工肉制品越来越受到广大消费者青睐。但加工肉制品的理化性质、营养成分和食用安全性易受各种加工及贮藏环境因素的作用而产生变化,如蛋白质变性和脂质氧化等。将AFP应用到肉制品储藏加工中,可有效提高产品品质。Yeh等[34]从乳酸链球菌中生产并重组了一种新型AFP,并将之添加在冷冻猪肉中,对解冻后体积、形状、颜色、质地、气味和接受度进行评估,结果表明添加AFP的猪肉汁液流失少,色泽质地较好,感官评价分数较高。微观结构中可以看出添加AFP的冷冻猪肉,细胞内冰晶较小,组织结构较完整。对冷冻猪肉的品质研究表明,AFP可以防止蛋白含量降低,减少营养流失,提高冷冻肉制品品质。Payne等[35]在羔羊宰杀之前,将南极鳕鱼AFGP注射入其体内,宰后-20 ℃冷冻储藏,扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)观察解冻羊肉微观结构,结果发现,在屠宰前1 h或24 h注射AFPG,都可有效减小冰晶体积,抑制重结晶现象,且减小程度与冷冻前浸泡AFGP的浓度和浸泡时间有关。实验证明在宰前24 h注射AFPG,且注射浓度为0.01 mg/kg时可有效减少渗水情况,羊羔肌肉中所形成的冰晶达到最小,保持了肉制品原有结构,营养成分流失最少。Boonsupthip[36]的研究则表明在冷冻和冷藏期间,III型AFP明显保留了罗非鱼肌动球蛋白Ca2+-ATP酶活性,有效阻止冷冻罗非鱼肉中肌肉蛋白形成凝胶状,抑制了冷冻肉的重结晶现象。结果显示,AFP III对冷冻罗非鱼肉的保护作用更是优于传统的低温保护剂(蔗糖-山梨糖醇混合物)。另外,解冻时,把畜禽肉浸泡在AFP溶液中也可明显减少冰晶的生成,抑制重结晶带来的汁液流失,水分迁移,蛋白质氧化和细胞损伤,从而保持产品品质和风味[30]。

2.3 AFP在冷冻面团中的应用

面团在冷冻状态下便于保藏和运输,得以迅速发展。然而,冷冻面团在冻藏过程中,表面失水使得内部水分缓慢移动到表面,造成面团中水分的丧失,使其表面产生皱缩、裂纹等现象,影响冷冻面团品质及外观[37]。另外,温度波动造成冷冻面团中冰晶产生重结晶,破坏面筋蛋白网络结构,降低冷冻面团品质,使其醒发时间延长、比容减少[38]。研究表明,可以通过添加冷冻保护剂来改善面团品质。AFP作为一类新型的食品添加剂,可以有效降低冷冻面团在冷藏过程中产生的负面影响,目前发现的此类AFP源有水产生物、大麦籽粒、冬麦草、燕麦、欧白英以及胡萝卜等[39]。

将水产源AFP应用于冷冻面团中,可显著改善产品的口感和营养价值。姬成宇等[40]研究了冻藏和冻融循环下鱼源AFP对冷冻面团的蛋白质特性以及水分子存在状态的影响,结果表明,AFP能够抑制二硫键的断裂和二级结构的变化,且降低冻融循环过程中面团水分的流动性,减少水分的迁移,有效的提高了面团的持水能力。另外,AFP的冰晶形态修饰作用和抑制重结晶效应均会减小酵母和面筋结构受破坏的程度,提高恒温冻藏下预发酵冷冻面团的比容,抑制酵母冻藏和冻融过程中产气力,提高面团的持气能力[40]。Panadero等[41]提取了极地杜父鱼(Myoxocephalus aenaeus)的AFP,并在工业酿酒酵母菌株中合成并重组成一种Ⅰ型AFP GS-5,在面包酵母中,GS-5的外源表达增加了冷冻耐受性,并在冷冻面团中增强了产气能力,减弱了冻融循环过程对冷冻面团面筋结构的弱化作用,并有效保护冷冻面团超微结构,总之,冷冻面团中鱼源AFP的表达可有效增加酵母细胞的活力,提高冷冻面团的品质。李灵等[42]通过将鲨鱼源AFP添加到马铃薯面团中,研究在冻融循环条件下AFP对冷冻马铃薯面团品质的保护作用。结果表明,添加1% AFP可使马铃薯面团比容增大、发酵时间缩短、淀粉糊化度减弱、失水率降低,马铃薯馒头的硬度、咀嚼性和胶粘性都显著低于对照组,核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)分析显示AFP可以影响冷冻马铃薯面团中的水分状态,使深层结合水含量增加,半结合水含量减少,还能抑制水分流失,提高马铃薯面团的持水力。因此,AFP可作为冷冻马铃薯面团产品的低温保护剂。另外,将AFP应用在速冻面食,如汤圆、水饺中,可有效减少其营养物质的损失,提高速冻食品品质。单从硬度值上对AFP的应用价值考量,2.5%的AFP添加量是速冻汤圆的最佳添加量,与空白实验相比,添加AFP的汤圆呈现较光滑的外观且浊度降低,浑汤清晰透明,易被人们所接受[3]。

2.4 AFP在果蔬中的应用

2.4.1 AFP在转基因果蔬加工中的应用 果蔬在栽培、种植以及收获后低温保鲜储藏和速冻加工过程中都会遭受冷害。但是,传统的育种方法抗寒效果不佳,而转抗冻基因的果蔬品种则表现出良好的耐寒性,还可扩大种植范围,延长货架期。因此,近年来关于转AFP基因的果蔬品种逐渐增多。美国DNAP公司将水产源AFP通过基因工程使其在番茄中表达,培育出耐寒番茄新品种。研究发现AFP不仅降低了细胞内水分的凝固,还增加了细胞的存活率,该转基因番茄能在-6 ℃生存几个小时,并且其果实冷藏后不变形[5]。将冬季比目鱼AFP基因通过真空透析导入马铃薯、拟南芥和油菜中后,发现该转AFP基因生物的冰点降低了1.8 ℃,也证实了通过转基因技术,培育耐寒性植物的可行性[5]。利用转基因技术和分子生物学,使抗冻基因在目标果蔬中表达,其中成功案例还包括转AFP基因甜菜、柑橘、草莓、甘蔗、甜椒、葡萄等,这些转AFP基因的果蔬经研究表明具有耐寒性和耐储藏性[30]。

2.4.2 AFP在果蔬储藏中的应用 一般来说,果蔬贮藏时的温度越低,品质保持的越好,贮藏温度若能降低1 ℃,就可以明显延长某些果蔬的贮藏寿命[43]。新鲜果蔬贮藏时均需有适宜的最低温度,其贮藏的低温临界温度因品种不同而异,低于此温度会造成果蔬的冷害和冻害。速冻果蔬在冻藏解冻过程中常出现汁液流失、软烂、失去原有形态等问题,因此,AFP在果蔬的冬季贮存和保鲜中有重要的应用价值。Ruims等[44]研究了Ⅰ型AFP通过真空浸渍(58 KPa,5 min)于豆瓣菜中,通过色差、扫描电镜和萎蔫试验来评价AFP对豆瓣菜形态品质的影响。结果表明,经过真空浸渍AFP的样品,细胞壁更清晰,细胞形状更圆润,添加AFPⅠ的叶子具有更高的透气性,另外,AFP还可以降低豆瓣菜在冷冻过程中的冰晶尺寸、抑制再结晶现象,有效提高了冻藏蔬菜的品质。因此AFP可作为在冷冻食品,尤其绿叶蔬菜中重要的食品添加剂。Kong等[45-46]就AFP预处理对胡萝卜和樱桃质构、汁液流失、冰晶形态大小以及挥发性化合物的影响做了综合评价。结果表明,在冷冻过程中,AFP对果蔬冰晶形态进行了修饰。AFP预处理降低了冻藏和解冻过程对胡萝卜和樱桃造成的汁液流失以及对颜色和质构等物理特性的影响,抑制总花青素、挥发性物质、酚醛和抗氧化等成分的损失,提高了冷冻果蔬的品质,证实了其在体外的抗冻活性,从而证明了AFP在冷冻食品中的应用潜力。因此,AFP可在果蔬储藏及运输过程中减少汁液流失和营养成分的损失、减少细胞损伤以及保持食品质地。

2.5 AFP在乳制品中的应用

冰淇淋的加工和储藏过程中,冰晶感会严重破坏冰淇淋的质地和口感,因此控制冰淇淋中冰晶的尺寸、形状及分布可以有效改善冰淇淋的组织细腻程度,冰晶越小、分布越均匀,其口感越柔软细腻[47]。但是冰淇淋在凝冻、硬化、贮藏和运输过程难免遇到温度波动,不断的解冻和冻结现象会造成冰晶增大和重结晶现象,导致冰淇淋质地粗糙,口感不佳。美国DNAP公司将AFP添加于冰淇淋和冰奶中,消除了冰渣,改善了产品的质量和口感[30],因此可以证明AFP是潜在的冷冻乳制品添加剂。在冰淇淋的加工过程中,将传统的硬化步骤用1~100 mg/L的AFP添加到冷冻混合物中来替代时,结果发现可有效降低冰晶的重结晶率,改善成品的口感细腻度[48]。在探究AFP对冰淇淋口感的影响时,把少量的AFP加入到已融化的冰淇淋样品中,于-80 ℃下迅速冷冻,在-6~-8 ℃下放置1 h后,可观察到,与对照相比,添加AFP的样品中冰晶明显变小[30]。研究表明,将AFP添加到冷冻乳品如冰奶、冷冻酸奶、软香乳冻、冰冻果子露以及冷冻甜食如冰糕、冰沙、冷冻果浆中,能够形成一种牢固的、密集的连续网络结构,有效抑制了冷冻乳制品在储存过程中冰晶的形成和重结晶等现象,使其品质得到显著的改善[30]。将AFP应用在乳制品中,可有效降低冰渣对产品的影响,提高产品的细腻润滑度,使其口感更佳,质量更好。

3 结论与展望

抗冻蛋白因具有热滞活性、修饰冰晶形态、抑制冰晶重结晶、降低过冷却点和保护细胞膜等作用而具有广阔的应用前景[3]。目前,对抗冻蛋白的作用机理及应用虽已有较为深入、广阔的研究,但由于其提取率低、性质不稳定,而人工合成又存在成本高、安全性等问题使其在规模化生产应用方面受到很大限制[30]。未来应通过基因工程和分子生物学等方法手段共同致力于抗冻蛋白的应用研究,实现低成本、高质量、大规模的抗冻蛋白开发,将抗冻蛋白应用在食品加工和储藏中,以期减少细胞损伤和营养流失,保持产品品质和风味,提高食用安全性等。因此,随着科学的进步,抗冻蛋白将在食品工业、生物材料的保存、医药领域、抗寒性相关转基因工程甚至更广阔的领域有更为广泛的应用。

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