酸浆茎叶黄酮精制工艺及抗氧化活性研究

李 群孙明哲吴 威姜秀娟曹柏营

LI Qun1 SUN Ming-zhe1 WU Wei1 JIANG Xiu-juan2 CAO Bai-ying2

(1. 长春职业技术学院食品与生物技术分院，吉林 长春 130033；2. 吉林工程技术师范学院食品工程学院，吉林 长春 130052)

(1. Food and Biological Technology College, Changchun Vocational Institute of Technology, Changchun, Jilin 130033, China; 2. Food Engineering College, Jilin Engineering Normal University, Changchun, Jilin 130052, China)

酸浆(PhysalisalkekengiL.)属多年生茄科植物，别名红姑娘、灯笼草[1-3]。酸浆宿萼、全草、果实均可入药，具有清热解毒、化痰止咳的功效[4]，在《维吾尔医常用药材》中记载了成熟酸浆全草的抗炎、护肝和利尿等功效[5]。酸浆茎叶中含有木犀草素、槲皮素和挥发油等化学成分[6-7]，木犀草素等黄酮类化合物在抗炎[8]、抗菌[9]、抗肿瘤[10]、抗病毒[11]等方面具有显著的生理活性，因此，值得深入探究酸浆茎叶的功效成分及其作用机理。

目前关于酸浆宿萼黄酮提取、纯化及生物活性研究的报道较多[12-14]，但酸浆茎叶黄酮的报道仅体现在黄酮含量方面[15]，关于酸浆茎叶黄酮的提取工艺优化，精制及抗氧化活性方面未见报道。本研究拟以长白山野生酸浆茎叶为原料，提取酸浆茎叶黄酮，利用大孔树脂进行精制工艺优化，并从体外和体内评价酸浆茎叶黄酮的抗氧化活性，为酸浆资源的精深加工提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

酸浆茎叶：采自长白山山区，自然晾干，试验前用烘箱(60～70 ℃)干燥后粉碎、过80目筛子备用；

SPF昆明小鼠[合格证号：SCXK(辽)2015-003]：辽宁长生生物技术有限公司。

1.1.2 试剂与仪器

ABTS[2，2′氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐]：分析纯，美国Sigma公司；

XDA-1、D101、AB-8和X-5型大孔吸附树脂：天津允开树脂科技有限公司；

T-AOC(总抗氧化能力)、GSH-Px(谷胱甘肽过氧化物酶)、SOD(超氧化物歧化酶)、MDA(丙二醛)检测试剂盒：山东博科生物产业有限公司；

亚硝酸钠、氯化亚铁、亚油酸、硫氰酸等：分析纯；

紫外可见光分光光度计：UV-2102C型，尤尼柯(上海)仪器有限公司；

多功能粉碎机：CS-700Y型，永康市天祺盛世工贸有限公司；

分析天平：AL104型，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；

旋转蒸发器：RE52-99型，上海亚荣生化仪器厂；

真空冷冻干燥机：ALPHA 1-4 LD PLUS型，德国Marin Christ 公司；

离心机：1-16型，德国Sigma公司；

全自动生化分析仪：BK-400 BIOBASE系列分立式，济南鑫贝西生物技术有限公司。

1.2 酸浆茎叶黄酮粗提取物的制备

以72%乙醇作为提取溶剂，按1∶28 (g/mL)料液比，在67 ℃的条件下提取酸浆茎叶3.8 h，过滤，减压浓缩，冷冻干燥备用。

1.3 酸浆茎叶黄酮粗提取物的精制

1.3.1 吸附率与解吸率的计算 参照文献[16]测定酸浆茎叶黄酮含量，分别按式(1)、(2)计算吸附率和洗脱率。

(1)

(2)

式中：

A——吸附率，%；

D——解吸率，%；

C0——粗提液中酸浆茎叶黄酮的含量，mg/g；

C1——大孔树脂吸附后的酸浆茎叶黄酮含量，mg/g；

C2——洗脱后溶液中酸浆茎叶黄酮含量，mg/g。

1.3.2 大孔吸附树脂的优选 取5 g酸浆茎叶黄酮粗提取物冻干粉，用500 mL去离子水溶解完全，得到酸浆茎叶黄酮粗提液(黄酮含量0.52 mg/g)。再称取XDA-1、D101、AB-8和X-5型大孔吸附树脂各5 g，与50 mL酸浆茎叶黄酮粗提液置于三角瓶中，室温震荡24 h，过滤除去树脂，测定滤液中酸浆茎叶黄酮含量，计算吸附率；取吸附饱和后的树脂，以50 mL 70%的乙醇溶液，室温震荡12 h，测定酸浆茎叶黄酮含量，并计算洗脱率。

1.3.3 静态吸附曲线 称取AB-8型大孔树脂5 g， 与50 mL 酸浆茎叶黄酮粗提液混合置于三角瓶中，室温震荡，每隔20 min测定酸浆茎叶黄酮的含量，并绘制吸附率—时间曲线。

1.3.4 吸附液体积的影响 称取AB-8型大孔树脂5 g，分别加入酸浆茎叶黄酮粗提液25，50，75，100，125，150 mL于三角瓶中，室温震荡12 h，测定滤液中酸浆茎叶黄酮含量，计算吸附率。

1.3.5 洗脱剂的优化 配制浓度为10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，95%的乙醇溶液各50 mL，加入吸附饱和的AB-8树脂5 g，室温震荡12 h后过滤，测定其中的酸浆茎叶黄酮含量，并计算洗脱率。

1.3.6 洗脱流速的优化 预处理完毕后，将大孔树脂装于层析柱中(Φ6.0 cm × 80 cm)，平衡12 h，加入酸浆茎叶黄酮粗提液20 mL，待粗提液全部进入树脂层后，以70%乙醇进行洗脱，调整洗脱流速分别为0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL/min，洗脱完毕，合并洗脱液并测定酸浆茎叶黄酮含量，计算洗脱率。

1.4 酸浆茎叶黄酮体外抗氧化活性

(1) 对亚硝基离子的清除作用：参照文献[17]。

(2) 对ABTS+·的清除作用：参照文献[18]。

(3) 对亚油酸脂质过氧化的抑制作用：参照文献[19]。

(4) 总抗氧化能力(T-AOC)的测定：按照试剂盒说明书测定。

1.5 酸浆茎叶黄酮体内抗氧化活性

1.5.1 动物分组及给药 取18～22 g 的SPF昆明小鼠60只，适应饲养1周，随机分为5组，即对照组(生理盐水)、抗坏血酸组(15 mg/kg·BW)、酸浆茎叶黄酮低剂量组/PSF-L(100 mg/kg·BW)、酸浆茎叶黄酮中剂量组/PSF-M(200 mg/kg·BW)和酸浆茎叶黄酮高剂量组/PSF-H(400 mg/kg·BW)。试验时间为5周，灌胃给药，每周计量小鼠体重，按式(3)计算小鼠体重增量，最后一次给药4 h后，摘除眼球并取血，分离血清(4 000 r/min，20 min)，最后放入-80 ℃冰箱中备用。采血完毕后处死小鼠，解剖并取胸腺、肝脏和脾脏，清洗干净后吸干称重，然后分别按式(4)～(6)计算小鼠的胸腺系数、肝脏系数和脾脏系数。

(3)

(4)

(5)

(6)

式中：

B——小鼠体重增量，%；

T——小鼠胸腺系数，%；

L——小鼠肝脏系数，%；

S——小鼠脾脏系数，%；

M1——小鼠初体重，g；

M2——小鼠终体重，g；

X——小鼠胸腺重量，g；

G——小鼠肝脏重量，g；

P——小鼠脾脏重量，g。

1.5.2 小鼠血清生化指标测定 在4 ℃下解冻小鼠血清，按试剂盒操作说明测定血清T-AOC、GSH-Px、SOD和MDA含量。

1.6 数据处理

2 结果与分析

2.1 酸浆茎叶黄酮的精制工艺优化

2.1.1 大孔树脂优选 不同大孔吸附树脂对酸浆茎叶黄酮的吸附率和洗脱率见图1。由图1可知，AB-8树脂对酸浆茎叶黄酮的吸附率和洗脱率最高，分别达到86.25%和88.37%，明显优于其他树脂。AB-8属于弱极性树脂，对酸浆茎叶黄酮中的酚羟基和糖甙键的结合能力较强，同时洗脱也比较容易，因此本试验选用AB-8树脂精制酸浆茎叶黄酮粗提液。

不同大写字母表示吸附率之间差异显著；不同小写字母表示洗脱率之间差异显著(P<0.05)。

图1 不同大孔树脂对酸浆茎叶黄酮吸附率和洗脱率的影响

Figure 1 The adsorption and desorption of microporous adsorbent resins on PSF

2.1.2 静态吸附曲线 AB-8树脂对酸浆茎叶黄酮的吸附过程较缓慢，主要包含物理吸附和化学吸附，其吸附速率与时间的关系见图2。由图2可见，随吸附时间的延长，酸浆茎叶黄酮的吸附率呈先增加后平缓的趋势，超过200 min后，吸附率变化较小，吸附树脂达到物理饱和状态，此时吸附率可达82.25%，AB-8树脂吸附酸浆茎叶黄酮属于单分子吸附[20]，更加利于酸浆茎叶黄酮的洗脱。

2.1.3 吸附液体积的影响 由图3可见，随着酸浆茎叶黄酮粗提液吸附体积的增加，吸附率在15 BV 时达到最大值(84.89%)，之后吸附趋于下降状态，在30 BV时吸附率降至81.85%，由于吸附液浓度过大造成树脂堵塞，影响酸浆茎叶黄酮的吸附，导致吸附率降低。

图2 静态吸附速率曲线

不同字母表示吸附率差异显著(P<0.05)

2.1.4 洗脱剂的优化 由图4可见，在乙醇浓度70%时达到最大值(82.68%)，此时吸附树脂中的大部分酸浆茎叶黄酮都被洗脱出来，而后洗脱率随乙醇浓度的增大而减小。乙醇浓度70%时，酸浆黄酮与洗脱溶剂间的缔合作用力最强，能够更多地从树脂上解吸下来，乙醇浓度增大后，缔合作用力减弱，解吸率降低。

2.1.5 洗脱流速的优化 由图5可见，洗脱流速在0.5～2.0 mL/min 时，洗脱率呈线性增大，在2.0 mL/min时，达到最大值(84.38%)，此后，洗脱流速继续增加，但洗脱率减小。洗脱流速过低时，树脂内部的酸浆黄酮洗脱不够充分，洗脱周期延长；而洗脱流速过大则导致部分黄酮未能及时被洗脱出来，同样导致洗脱率降低。因此，综合考虑，洗脱流速确定为2.0 mL/min。

不同字母表示洗脱率差异显著(P<0.05)

不同字母表示洗脱率差异显著(P<0.05)

2.2 酸浆茎叶黄酮体外抗氧化活性

图6 酸浆茎叶黄酮的体外抗氧化活性

2.3 酸浆茎叶黄酮体内抗氧化活性

2.3.1 酸浆茎叶黄酮对小鼠体质指数的影响 酸浆茎叶黄酮对小鼠体质指数的影响见表1。由表1可见，与对照组比较， 抗坏血酸组、酸浆茎叶黄酮低、中、高剂量组的体重增量和肝脏系数未发生显著变化(P>0.05)，表明酸浆茎叶黄酮的毒性较低，动物的脏器未发生明显的病变及损伤；在不同剂量的酸浆茎叶黄酮组中，胸腺系数和脾脏系数都明显高于对照组(P<0.05)，表明酸浆茎叶黄酮对小鼠的免疫功能具有一定的调节作用，效果优于抗坏血酸组(P<0.05)。酸浆茎叶黄酮表现出一定的免疫调节活性。

2.3.2 酸浆茎叶黄酮对小鼠血清生化指标的影响 由表2可见，抗坏血酸组、酸浆茎叶黄酮低、中、高剂量组的T-AOC、GSH-Px和SOD水平明显高于对照组(P<0.05)，且中、高剂量组均高于抗坏血酸组(P<0.01)；抗坏血酸组、酸浆茎叶黄酮各剂量组的MDA水平明显低于对照组(P<0.01)，表明酸浆茎叶黄酮可显著降低小鼠体内脂质过氧化物的含量。酸浆茎叶黄酮各剂量组都表现出较好的抗氧化活性。

3 结论

表1 酸浆茎叶黄酮对小鼠体质指数的影响†

† *表示P<0.05，**表示P<0.01(与对照组比较)；△表示P<0.05，△△表示P<0.01(与抗坏血酸组比较)。

表2 酸浆茎叶黄酮对小鼠血清生化指标的影响†

† *表示P<0.05，**表示P<0.01(与对照组比较)；△表示P<0.05，△△表示P<0.01(与抗坏血酸组比较)。

酸浆茎叶黄酮表现出较强的体外和体内抗氧化活性，关于酸浆茎叶黄酮抗氧化活性的机制及其他生物活性将在后续研究中进行探讨。