MDBK细胞悬浮培养驯化方法及悬浮细胞系的建立

一、材料与方法

1.材料。MDBK细胞，金宇保灵兽用疫苗国家工程实验室保存。DMEM培养基、胰酶、低血清培养基，均购自赛默飞世尔科技有限公司。无血清悬浮培养基购自上海奥浦迈生物科技有限公司。

2.方法。

（1）低血清培养驯化：取正常生长的贴壁MDBK细胞，在培养基中添加部分低血清培养基，当细胞适应生长后逐渐加大低血清培养基添加量，直至全部更换为低血清培养。待细胞完全适应低血清培养后冷冻保存，备用；

（2）低血清悬浮培养驯化：取已适应低血清培养的贴壁MDBK细胞，用胰酶消化后，按照5×105cells/ml加入三角摇瓶中进行悬浮培养，培养条件为：37℃，110 rpm，5%二氧化碳。待细胞适应悬浮培养后，冷冻保存，备用；

（3）无血清悬浮培养驯化：取已适应低血清悬浮培养的MDBK悬浮细胞，在低血清培养基中添加部分无血清培养基，当细胞适应生长后逐渐加大血清培养基添加量，直至全部更换为无血清培养。

二、结果与分析

在驯化过程中出现了细胞活力低、细胞死亡、生长缓慢、细胞聚团等一系列问题，通过以下方法得以解决：

MDBK-S悬浮细胞

1.细胞活力低、死亡问题，通过持续添加待驯化细胞提高细胞密度或更换部分培养基得以改善。

2.细胞生长缓慢问题，通过筛选适宜的培养基，及时补充葡萄糖及谷氨酰胺，调整转速来解决。

3.细胞聚团问，通过消化分散添加葡聚糖或细胞沉降、筛网过滤获取单个细胞。通过上述方法持续改进，最终获得分散良好的MDBK细胞株。该悬浮细胞命名为MDBK-S，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.11795。细胞呈圆形，直径14～25 μm，细胞分散均匀，可在不依赖附着物的情况下纯悬浮培养，通过溶液优化与筛选细胞密度可达107cells/ml以上，细胞平均倍增时间35 h左右。

三、讨论

通过初步试验，该细胞可用于牛病毒性腹泻/粘膜病、牛传染性鼻气管炎、牛呼吸道合胞体、牛副流感3型等病毒的培养，单位体积病毒产量可提高5～10倍，应用前景广阔。

悬浮培养相比贴壁培养的优势在于，可利用反应器大量培养细胞，生产放大工艺简单，批间差较小，劳动强度小，占地空间少，生产效率提升明显。

参考文献（略）