不同时期艰难梭菌感染状况分析*

刘元元 李晓哲 董海新

(济宁医学院附属医院，济宁 272000)

艰难梭菌，是定植在人类肠道的正常菌群，一旦菌群失调，成为条件致病菌后，轻可引起腹泻，重则导致爆发性伪膜性肠炎，甚至死亡。近十几年来，随着抗生素的不合理使用，世界范围内艰难梭菌感染日趋严重，已成为美国院内感染最主要的致病菌[1]，欧洲也发生了多次暴发事件[2]。分析认为可能与高毒力菌株核糖体分型027型播散有关。我国大陆地区90年代后陆续开始艰难梭菌感染监测，2015年已有027型的报道[3]。由于国内研究起步晚，目前仅有局部的研究报道，尚无全国性的流行病学调查数据。笔者调查了济宁医学院附属医院艰难梭菌感染状况。报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选自2014年1月至12月住院病人腹泻患者106例(前期组)及2016年1月至12月腹泻患者90例(后期组)，大便通常为稀便、水样便或半成形便，腹泻≥3次/24h，持续超过2d。

1.2 试剂与仪器

艰难梭菌显色培养基、厌氧罐、艰难梭菌毒素检测试剂盒、VIDAS荧光免疫分析仪(梅里埃公司)，细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN) ，基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-MS)。

1.3 方法

1.3.1艰难梭菌培养 将粪便标本与等比例无水乙醇混合，室温静置1h，漩涡震荡混匀后离心，取沉淀接种于艰难梭菌鉴别培养基或显色培养基上，37℃厌氧培养48h。取可疑菌落进行耐氧试验，染色镜检，观察是否为革兰阳性芽孢杆菌。镜检符合者传代培养，采用质谱仪进行菌种鉴定。

1.3.2艰难梭菌毒素A/B检测 按照操作说明书，取适量粪便标本加于样本稀释液中震荡混匀，离心取上清，加入毒素检测试剂条加样孔中，放入VIDAS仪器中检测。

1.3.3艰难梭菌PCR毒素检测 采用细菌基因组DNA提取试剂盒，按操作说明，提取艰难梭菌基因组DNA，进行tcdA、tcdB基因扩增。引物参照前期设计，反应体系为25μl，包括上下游引物1μl、模板DNA 2μl、Taq Master Mix 12.5μl、去离子水8.5μl，扩增程序：95℃ 1min，95℃ 15s、62℃ 2min、72℃ 40s(tcdA),95℃ 20s、55℃ 30s、60℃ 2min (tcdB)30个循环，72℃ 延伸10min。扩增完成后，1%琼脂糖凝胶电泳30min。

1.4 统计学方法

应用SPSS17.0软件进行数据分析。

2 结果

2.1 不同方法艰难梭菌检测情况

为验证两种不同检测方法检测艰难梭菌的情况，将前期组106 例及后期90例非重复标本合并，综合比较，厌氧培养阳性率15.82%(31/196)与酶免疫分析检测阳性率12.24%(24/196)差异无统计学意义(P>0.05)。两种方法诊断结果一致性一般(Kappa=0.684，P<0.001)，见表1。厌氧培养所得艰难梭菌经PCR扩增，前期组培养阳性菌株16例均可检测出毒素A、B,后期组13株毒素阳性，2株毒素阴性，产毒株阳性率为14.4%。见图1。

图1 毒素扩增结果

注：经McNemar检验，P=0.118。

2.2 不同时期艰难梭菌检测情况

无论采用哪种方法，前期后期艰难梭菌感染率都在10%以上。经比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 不同时期同一方法艰难梭菌检出情况比较

2.3 艰难梭菌培养阳性患者临床分布情况

前期组均为成人标本，主要分布科室为外科，在性别分布上无统计学意义(P>0.05)。后期组未限制年龄，儿科、血液、肾内所占比例较高，在年龄及性别分布上差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。住院期间阳性患者多单一或联合使用过一代、三代头孢类、喹诺酮类等抗生素。

表3 培养阳性患者分布情况

3 讨论

目前艰难梭菌检测方法有多种，不同方法各有优缺点。一般公认的最好方法为组织细胞毒素检测，该方法敏感性、特异性可达98%以上，主要缺点是技术要求高，检测周期相对较长，而且操作繁琐，无法实现标准化操作。厌氧培养耗费时间较长，需要专门的厌氧设备，接种要求苛刻，但对于菌株的基因分型以及检测药物敏感性等仍具有重要的应用价值；酶免疫学方法操作简便快速，实用性好，灵敏度、特异度相对较低，适合临床快速筛查和早期诊断；核酸扩增方法实验要求高，仪器昂贵，但较敏感、特异。本文选用显色培养、酶免法、PCR方法，阳性率无显著差异。前期厌氧培养曾选用成品艰难梭菌鉴别平板，但阳性率较低。改用显色平板后，阳性率明显提高，同其他报道结果一致。

本文显示，艰难梭菌感染患者中男女阳性率虽有一定差异，但并无统计学意义，而国内荟萃分析表明[4]，男性比女性感染率要高。分析原因可能是不同地区、不同医院感染状况本身存在不同或者标本量不充足所致的偏倚，为排除该偏倚，下一步应继续增大标本量。一直以来普遍认为高龄是艰难梭菌感染的危险因素之一，>65岁成人是感染的主要人群[5-7]。有研究者对不同年龄人群感染状况分析发现，1岁以内随月份增加儿童艰难梭菌感染率有上升趋势，所以儿童艰难梭菌感染也不容忽视。故后期收集的标本包含来源于儿童的部分。从后期阳性标本看，儿童和成人感染率也无统计学差异，说明我院艰难梭菌感染涵盖年龄跨度大，需普遍关注。

两个时期进行显色培养及酶免疫学检测阳性率基本一致,说明从2014年至2017年院内持续有艰难梭菌感染发生，且感染率前后并无大的差别，与国内艰难梭菌感染率水平相符[8]。在医院科室构成上，外科、儿科、血液、肾内等阳性率相对偏高，其他科室也有散在分布，表明我院艰难梭菌感染范围广泛，但又有集中某些科室分布的趋势。可能与这些科室抗生素使用过多、住院时间长，环境定植污染等因素有关。长期以来，医院一直在规范抗生素的合理使用，严格遵循抗生素使用分级管理制度，减少抗生素滥用，而且尽量缩短患者住院时间，加强工作人员手卫生及患者周围环境卫生，对特殊感染患者进行隔离治疗。尽管如此，我院艰难梭菌感染形势依然不容乐观，院感部门应加大监控力度，尤其是对感染率高的科室应严密监测，及时制定有效预防控制措施，减少定植与传播。