分子排阻色谱法测定肝素钠注射液分子量与分子量分布的不确定度分析

肝素钠是由猪或牛的肠黏膜中提取的硫酸氨基葡聚糖的钠盐，属黏多糖类物质。肝素钠注射液作为一种黏多糖硫酸酯类抗凝血药物，常用于防治血栓形成或栓塞性疾病，如心肌梗死、血栓性静脉炎、肺栓塞等。研究表明[1-3]，肝素钠的抗凝血活性和抗栓活性及其结构以及分子量密切相关。《中华人民共和国药典》二部中采用分子排阻色谱法（SEC）来测定肝素钠及其注射液的分子量与分子量分布，作为质量控制的一个重要条件[4]。在实验室评定时，根据中国合格评定国家认可委员会要求，出具结果的实验室应能进行不确定度的评定程序，并对检验结果不确定度进行合理的评定，确保报告结果表达的准确性[5,6]。本研究以肝素钠注射液为例，根据《化学分析中不确定度的评估指南》（CNAS-GL06）[7]和国家计量技术规范《测量不确定度评定与表示》[8]，对分子排阻色谱法以肝素宽分布标准样对照品测定肝素钠中分子量与分子量分布的不确定度进行了测量和评定，考察其不确定度的主要来源，为实验过程控制和评价检定结果提供了合理的科学依据。

1 仪器与试药

Waters 2414高效液相色谱仪（Waters中国有限公司，配示差折光检测器），XSE205电子天平（梅特勒-托利多公司），Milli-Q超纯水器（美国Millopore公司）。

肝素分子量对照品（中国食品药品检定研究院，批号：140819-201501）；肝素对照品（中国食品药品检定研究院，批号 140818-201501）；肝素钠注射液（某厂家，批号160409）；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

2 试验方法

2.1 仪器操作条件 色谱柱：TSK预柱（6 mm×40 mm），TSK 4000SWxl（8 mm×300 mm，8 μm），TSK 3000SWxl（7.8 mm×300 mm，8 μm），三根串联。流动相：0.1 mol/L醋酸铵溶液；流速：0.6 ml/min；柱温：30 ℃；进样量：25 μl；检测器温度：30 ℃；Empower PRO色谱工作站。

2.2 对照品溶液的制备 取肝素分子量对照品约25 mg，精密称定，置5 ml量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为宽分布标准样对照品溶液。另取肝素对照品约25 mg，精密称定，置5 ml量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为系统适用性溶液。

2.3 供试品溶液的制备 取肝素钠注射液10支，混匀，精密量取2 ml，置5 ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。精密量取2 ml，置5 ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

2.4 样品的测定 采用分子排阻色谱法[9]分取宽分布标准样对照品溶液、系统适用性溶液20 μl进样，同一供试品溶液20 μl重复进样10次，采用Empower Pro工作站配置的GPC软件处理数据，选用三阶曲线拟合方程。

3 不确定度的评定

3.1 建立数学模型 分子排阻色谱法是根据待测组分的分子大小进行分离的一种液相色谱技术。本试验根据不同分子量的肝素钠在色谱柱上的洗脱时间（T）与重均分子量（Mw）的对数呈一定关系，用已知分子量分布的单一肝素分子量对照品（分子量基本从6000 Da至40 000 Da呈宽分布）制作标准曲线，然后将样品用纯水配制成与对照品相同浓度的进样，由样品的 T从曲线中求得样品的 Mw。其原理可用公式表示如下：

式中：logMw为对照品Mw的对数，T为洗脱时间，B为校正曲线的截距，A为校正曲线的斜率。

3.2 测量不确定度的来源 由建立的测量数学模型可知，分子排阻色谱法中样品浓度不影响测定结果，因此样品制备过程的不确定度可忽略。校正曲线和测量精密度是其不确定度的主要来源[10,11]。

3.3 各不确定度分量的评定

3.3.1 测量精密度引入的不确定度 对于同一肝素注射液样品进行10次平行测定，测定结果列于表1。

所测得的分子量平均值为：

样本标准差为：

测量结果的标准不确定度为：

测量结果的相对标准不确定度为：

表1 同一样品的重均分子量测定结果

3.3.2 校正曲线引入的不确定度 按 2.2方法中GPC软件采用三阶相关曲线拟合方式，将肝素宽分布分子量对照品各重均分子量的对数与对应洗脱时间的数据进行处理，得到相对分子量标准线性拟合的标准曲线为 logMw=12.2－0.645T+0.0189T2－0.000 21T3，r=0.999 998。表2列出了肝素分子量对照品宽分布标样在各统计点的分子量和保留时间，以及通过三阶拟合方程计算的数据结果。该曲线拟合是一种用连续曲线近似的描述平面上离散点组所表示的坐标之间的函数关系的数据处理方法[12]，因此，根据实际情况需要，先将非线性拟合的数据采用乘幂线性化法转化为线性化数据[13]，由表 2的数据借助乘幂线性化回归方程计算三阶拟合曲线的标准偏差。转化后的校正曲线公式如下：

式中：logMw为对照品Mw的对数；T0为洗脱时间T的k次乘幂（k=0.7）。

对样品进行一次测定，测得的重均分子量Mw为16 027，其对数l0gMw为4.204 852，保留时间T为29.500 min，T0.7为 10.687 min。

根据贝塞尔公式计算标准曲线的剩余标准差为：

表2 肝素分子量对照品重均分子量及保留时间

式中：b为乘幂线性化回归方程的斜率，b=0.3250；n为标准系列的点数，n=15；m为读数次数，m=1；p为测量样品次数，p=1；为标准系列个点保留时间T0.7的平均值，=10.434 min；xi为标准系列个点保留时间T0.7；为测试样品浓度的平均值，=10.687 min。

所以，logMw=4.261 017±0.001 636；取反对数后，Mw的分布区间为18 171≤Mw≤18 309。因此，校正曲线的标准不确定度为 =18 309－18 171=138，相对不确定度：

3.4 合成相对标准不确定度、合成标准不确定度、扩展不确定度 综合各分项不确定度分量的评定结果，最终得到测定肝素钠注射液分子量的合成相对不确定度：

则合成标准不确定度：

3.5 扩展不确定度 取置信度 P=95%，包含因子k=2，则扩展不确定度：

3.6 实验结果 通过对整个分析过程不确定度的分析以及样品测定的结果，得出分子排阻色谱法测定肝素钠注射液的分子量为：

4 结论

通过对分子排阻色谱法测定肝素钠注射液分子量的不确定度进行评定，在评定过程中，由于不能直接根据GPC软件处理实验结果得到的标准曲线三阶拟合方程建立模型，来进行不确定度评估，因此借助乘幂线性化方法将GPC软件统计处理的标准曲线三阶拟合方程转化为最小二乘阶方程。转化后的方程不但能准确保留原三阶连续曲线所表示的坐标之间的关系，更能根据简化后的方程建立数学模型，从而进行实验的不确定度评定。

根据实验模型和试验分析发现，试验过程中影响不确定度分子量主要来源于测量精密度和标准曲线，与样品的浓度无关，因此，在试验过程中，供试品溶液及对照品溶液的浓度无特殊要求，也无需考虑稀释步骤所引入的不确定度因素；而且试验中，通过对照品溶液分子量的分布和保留时间计算得到校正曲线，此因素对不确定度的贡献较大，这一因素与对照品自身的结构、分子量的分布情况有关。肝素对照品是一种分子量宽分布的对照品，配制成的对照品溶液只需要一份，其中肝素的分子量呈6000 Da～40 000 Da的宽分布结果；而一般分子排阻色谱法多采用窄分布标准样，每个标准样品只有一个分子量，需要配制几个大小不同的分子量标准样品来绘制标准曲线。因此，在试验过程中，要想获得较小不确定度的测量结果，对照品的选择尤为重要，要选择合适的、结构与待测物一致的对照品，才能保证测定结果的准确度。