microRNAs与阿片类药物耐受*

张腾蛟 华 震

（北京医院手术麻醉科 国家老年医学中心，北京100730）

阿片类镇痛药一直是临床控制各种中、重度疼痛的核心药物，在过去的几十年里随着镇痛需求的不断增加而被越来越广泛的使用[1]。长期、大量使用阿片类药物，可导致药物耐受、痛觉过敏等副作用出现，严重影响临床使用的安全性与舒适性[1]。关于阿片类药物耐受（阿片耐受）的发生机制和防治方法的研究报道很多，但至今没有定论。microRNAs (miRNAs) 作为转录后水平调节基因表达的非编码RNA，已被报道参与阿片耐受的发生及发展。阿片类药物不仅可导致神经组织或细胞中多种miRNAs表达水平的变化（见表1），而且不同药物之间还存在着miRNAs表达种类和程度的差异性[2～5]。目前还没有关于miRNAs和阿片耐受研究进展的文献见刊，为此本文对近年来此领域的研究进行综述。

一、阿片耐受机制概述

阿片耐受是指长期使用阿片类药物导致的药物镇痛效力在固定剂量下的逐渐降低，通常需要增加剂量才能维持最初的镇痛水平[6]。神经系统内存在多种类型的阿片受体 (μ、κ、δ等)，它们均是典型的抑制性G蛋白偶联受体[7]。μ阿片受体 (μ opioid receptors, MORs) 在中枢和周围神经系统内广泛分布，在中枢主要分布于大脑皮层、边缘系统、丘脑、纹状体、海马、蓝斑和脊髓背角的浅层等[8]。敲除MORs基因后，吗啡等阿片类药物不仅丧失了镇痛作用，而且不再引起药物耐受、痛觉过敏、药物成瘾等副作用，这表明MORs对于阿片类药物的“正反”两方面作用都是至关重要的，MORs是研究阿片耐受的核心之一[7,9]。

Corder G等[9,10]利用基因工程技术成功制备了仅在周围神经伤害性感受器不表达MORs的小鼠（在中枢神经系统正常表达），长期皮下注射吗啡后，发现小鼠仍保持着正常的镇痛作用而没有产生镇痛耐受；将不透过血脑屏障而仅作用于外周的MORs拮抗剂甲基纳曲酮溴化物 (methylnaltrexone bromide,MNB) 与吗啡同时注射，取得了与条件性敲除小鼠相同的结果。然而，已被证实参与吗啡耐受的小胶质细胞[10]在条件性敲除小鼠中仍然高度活化，这表明外周伤害性感受器的MORs极有可能是形成吗啡耐受的决定性节点[9]。

MORs下调和神经适应 (neuroadaptation) 可能是阿片耐受的主要机制，MORs下调包括MORs表达减少和降解增加，神经适应包括突触可塑性 (synaptic plasticity) 和神经可塑性 (neuroplasticity)[11]。在DNA修饰、转录、转录后等不同水平，MORs表达都有可能受到调控，miRNAs主要在转录后水平调控MORs表达[12]。

一般认为，阿片类药物结合MORs后产生抑制性G蛋白信号而引起镇痛作用，但包括药物耐受、呼吸抑制和便秘等副作用可能与β-抑制蛋白-2 (β-arrestin-2) 对 MORs信号的调节有关[7,13,14]。在阿片类药物的作用下，G蛋白偶联受体激酶活性上调并催化MORs发生磷酸化，受体磷酸化后对β-arrestin-2的亲和力增加，β-arrestin-2的募集使受体与G蛋白解偶联即脱敏，解偶联后受体发生内化[15,16]。内化被认为是机体为避免MORs长时间持续性激活的一种生理保护性机制，因为受体可经过循环回到细胞膜上继续发挥作用即复敏[15]。但决定受体内化后命运的机制比较复杂，其也可能被转运到溶酶体直接降解掉，结果是细胞表面可用受体减少导致镇痛效力降低[11,16]。

长时程增强 (long-term potentiation, LTP) 是长期突触可塑性的主要表现形式，它是由于同步刺激两个神经元而发生在两个神经元信号传输中的一种持久的突触强度改变现象[17]。LTP也被广泛的认为参与伤害性通路的功能调节。电生理学研究证明阿片类药物在抑制伤害性感受器和脊髓背角神经元之间伤害性信息传递的同时，也可能产生突触可塑性改变，如LTP，这被认为可能有助于阿片耐受[18]。然而，LTP起源于突触前还是突触后是有争议的，并且也不确定LTP是否由伤害性感受器或脊髓神经元中的MORs激活引起[18,19]。但最新的一项研究结果提示，伤害性感受器中的突触前MORs信号导致阿片类药物诱导的脊髓LTP[9]。

活化的小胶质细胞和星形胶质细胞被认为是阿片耐受的重要贡献者，抑制神经胶质细胞的活化可以降低耐受性[20,21]。在机制方面，人们提出吗啡直接或间接作用于胶质细胞的许多可能途径，包括MORs、Toll样受体4、ATP受体P2X3和趋化因子受体等[20～22]。但随后的研究表明，敲除Toll样受体4的小鼠仍然产生了吗啡耐受[23]，神经胶质细胞中也未发现MORs的表达[9]。总之，神经细胞和神经胶质细胞在阿片耐受形成过程中的具体角色还没有完全清楚，它们启动阿片耐受的分子机制仍未彻底阐明。

二、miRNAs与阿片受体

1.miRNAs的一般作用

miRNAs是一种长度约20个核苷酸的非编码RNA，在动物中主要通过与靶基因mRNA的3非翻译区 (3ʹ-untranslated region, 3ʹ-UTR) 部分互补结合而阻止mRNA的翻译或使mRNA降解，在转录后水平上抑制靶基因表达[24]。但近年来，也有关于miRNAs激活靶mRNA、上调翻译的报道，并认为这与细胞周期有关，即当细胞处于非增殖状态时miRNAs可能上调靶mRNA的翻译，否则起抑制作用[5,25]。然而，人们对这种观点持有较大争议，具体机制有待阐明。目前认为，miRNAs作为表观遗传学的重要调节因子，可以广泛的参与调控包括神经生物反应在内的各类细胞活动，包括神经元生长、代谢、凋亡及突触可塑性等[26]。

2.miRNAs与阿片受体的表达

随着研究的不断深入，人们逐渐认识到长期吗啡治疗并未在转录水平改变MORs的mRNA生成量，而可能是在转录后水平造成的MORs最终表达量的降低[27]。

早在2008年，有研究发现microRNA-23b(miR-23b)可通过互补结合小鼠神经母细胞瘤细胞MORs的mRNA3ʹ-UTR进而抑制mRNA装配到核糖体上进行翻译，进一步的实验表明长期吗啡处理人神经母细胞瘤细胞以剂量和时间依赖性方式增加miR-23b表达，在转录后水平降低MORs表达[28]。同样用吗啡长期处理体外培养的小鼠海马神经元，miR-339-3p表达升高，miR-339-3p可以与MORs的mRNA3ʹ-UTR上的特定序列结合，进而使mRNA稳定性降低而衰变降解，MORs合成减少，这种情况可以被miR-339-3p抑制剂逆转[29]。在另一项用吗啡处理的体外研究中，也发现了两种通过结合MORs的mRNA3ʹ-UTR下调MORs表达的miRNAs-miR-212/132，认为吗啡激活MORs后通过胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK；MAPK家族的一员）和蛋白激酶A的级联信号通路引起环磷腺苷效应元件结合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB；一种可调节miR-212/132基因转录的蛋白质）的磷酸化，最终使miR-212/132表达上调30]。

大多数证据都支持吗啡下调MORs表达的观点，但也有不同的声音存在。有研究报道miR-16能够结合到MORs的mRNA3’-UTR靶位点上并抑制MORs基因的表达，发现吗啡通过抑制miR-16的表达而上调MORs水平，并且纳洛酮逆转这种作用[31]。需要说明，这一发现来源于CEM ×174细胞（一种淋巴细胞）的研究，与我们所要探讨的神经系统阿片耐受有明显区别。如果说上面的细胞水平研究不足以证明miRNAs在体内能够调节MORs的表达，那么下面的动物模型研究可以提供更确切的证据。

人们首先发现let-7家族miRNAs普遍存在能和MORs的mRNA3ʹ-UTR部分互补配对的序列，小鼠的let-7表达水平在长期吗啡治疗后显著上调，let-7被纳入RNA诱导的沉默复合物 (RNA-induced silencing complex, RISC) 中，RISC募集并隔离MORs mRNA进入缺乏翻译机制的处理体中，从而有效地减少了与核糖体结合的mRNA，导致翻译起始抑制、MORs表达下调，最终形成吗啡耐受；let-7生成抑制剂有效的减轻了小鼠吗啡耐受程度[27]。利用可卡因处理斑马鱼胚胎的研究为let-7参与MORs表达提供了更多的证据[32]。近期的一项研究通过皮下植入吗啡颗粒诱导小鼠吗啡耐受，发现miR-103和miR-107的表达水平在纹状体中明显升高，而在前额皮质中却没有明显变化，miR-103和miR-107结合MORs的mRNA3ʹ-UTR而阻止其装配到核糖体上进行翻译，参与吗啡耐受发展；miR-103和miR-107都是由泛素激酶家族基因的内含子转录的，除了3ʹ-末端有一个核苷酸不同外，这两种miRNAs具有相同的序列并且调节重叠的目标[33]。慢性吗啡处理后miR-103和miR-107出现区域差异性表达，目前还不知道这是否与MORs分布不均匀有关，还是存在其他调节机制。

至此我们可以认为，长期吗啡治疗可上调某些miRNAs的表达，后者主要与MORs的mRNA3ʹ-UTR部分互补结合而阻止mRNA的翻译而不是使mRNA降解，导致MORs生物合成减少、产生阿片耐受。考虑到一种miRNAs可以作用于多种靶基因而一种靶基因也可能受多种miRNAs调控[24]，同时注意到MORs的mRNA3ʹ-UTR是一段比较长的非编码区（人类通常由13000多个核苷酸组成）[3,4]，就可以理解MORs基因转录后调节的复杂性。目前尚不清楚上述多种miRNAs在阿片耐受性发展过程中的具体关联，但既然它们都能够和MORs的mRNA3ʹ-UTR上不同靶点结合而调节MORs的表达，那么它们可能共同参与了阿片耐受。

3.miRNAs与阿片受体的降解

β-arrestin-2是一种G蛋白偶联受体调节蛋白，敲除其表达基因后吗啡镇痛作用明显增强和延长，同时大大减轻了吗啡引起的药物耐受、呼吸抑制和急性便秘等[13,14]。

近来有研究者对β-arrestin-2参与吗啡耐受形成的机制做了拓展性的研究，发现靶向抑制βarrestin-2表达的miR-365在吗啡耐受大鼠脊髓水平显著下调，利用慢病毒介导的miR-365过表达有效的增强和延长了镇痛作用[3]。随后一组研究报道了相似的结果，并提出ERK/CREB是吗啡引起miR-365下调的上游调节通路，miR-365可能还与星形胶质细胞和小胶质细胞活化有关，过表达miR-365不仅提高了吗啡的镇痛作用而且减少了胶质细胞活化相关的细胞因子释放[35]。

然而，在此之前的研究发现，小鼠和大鼠海马神经元在体外经吗啡或芬太尼长期处理后miR-365的表达量上调，并提出MORs活化后经ERK通路调节多种miRNAs的差异性表达[4]。当然，这种看似矛盾的结果还需要进一步探讨，这种细胞模型与吗啡耐受动物模型的代表性差异是明显的。也有报道提出，miR-365通过靶向调节白细胞介素-6、细胞周期蛋白D1等参与免疫应答、肿瘤生成等过程[36]，此外一种可促进星形胶质细胞向神经元转化的转录因子也受miR-365靶向调节[37]。这些发现再次提醒我们注意miRNAs调节作用的复杂性，即一种miRNAs可能参与调控多种靶基因的表达。

三、miRNAs与神经适应

1.miRNAs与突触可塑性

N-甲基-D-天冬氨酸受体 (N-methyl-D-aspartate receptors, NMDAR) 主要分布于中枢神经突触处，脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)主要在神经系统内表达；NMDAR和BDNF是公认的形成LTP突触可塑性的重要分子，它们在阿片耐受过程中扮演着重要角色[17,18,38]。有报道称，BDNF清除剂TrkB-Fc（酪氨酸受体激酶B-Fc）能够缓解小鼠吗啡耐受[39]，非竞争性NMDAR拮抗剂MK-801明显减慢了吗啡耐受的进程[40]，但在临床上NMDAR拮抗剂无效或有明显神经毒性[17]。

一项通过长期吗啡皮下注射诱导小鼠吗啡耐受的研究报道，随着吗啡耐受的形成miR-219表达逐渐降低，其靶标钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶 IIγ (calcium/calmodulin-dependent protein kinase IIγ, CaMKIIγ) 表达逐渐升高，这种改变只发生在背根神经节中而在相对应的脊髓节段中miR-219、CaMKIIγ的表达均没有改变；同时依赖CaMKIIγ调节的BDNF表达量也升高，上调miR-219或下调CaMKIIγ、BDNF的表达均被证实能有效的减轻小鼠的吗啡耐受程度[39]。另一项通过长期鞘内注射吗啡诱导大鼠吗啡耐受的研究也得出了相似的结果，即在耐受形成过程中miR-219对CaMKII γ的靶向抑制作用减低，并提出NMDAR在miR-219介导的吗啡耐受中表达增加，NMDAR的表达受miR-219/CaMKIIγ通路的调节[41]。令人感兴趣的是，两组研究关于miR-219的表达定位出现了相反的结果，后一项研究表明随着耐受的形成miR-219在大鼠脊髓(L4-L5)中的表达逐渐降低，而前一项研究表明miR-219在小鼠脊髓 (L4-L6) 中的表达没有改变；由于后一项研究没有检测大鼠背根神经节中miR-219的表达变化，所以我们不能对两项研究做进一步的比较；这种矛盾的结果是否与动物模型、给药方式的差异有关，还是有其他方面的原因，目前还不能得出结论。

对于吗啡通过调节BDNF的表达导致镇痛耐受，同期的另一项研究发现了不同的调节通路。长时间皮下注射吗啡引起miR-375在小鼠背根神经节内逐渐降低，导致其直接靶标JAK2（Janus激酶2）表达调高，并通过JAK2/STAT3（信号转导和转录激活因子3） 通路引起BDNF表达升高，调节这条通路上的任一节点均被证实能部分的减轻吗啡耐受程度[42]。

上面的研究支持阿片类药物通过miRNAs调节CaMKIIγ、BDNF和NMDAR表达，进而引起阿片耐受的观点。BDNF是miR-1众所周知的靶标之一，神经病理性疼痛大鼠背根神经节中miR-1下调后，引起BDNF的高表达，被认为是痛觉过敏和异常疼痛的主要原因[43]。令人感兴趣的是，miR-1被发现在吗啡耐受小鼠前额皮质中下调[5]，这提示我们BDNF参与阿片耐受可能是miR-1直接调节的。此外有证据表明，神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞在阿片类药物的刺激下均可能分泌BDNF，后者又调节了NMDAR的表达[38,44]。总结来看，CaMKIIγ、BDNF和NMDAR三者诱导LTP的相互关系可能是：长时间激活的MORs引起神经突触处Ca2+上调和Ca2+/CaMKIIγ信号通路活化，接着触发BDNF的释放；BDNF一方面通过下游信号传导诱发LTP，另一方面又上调了NMDAR的表达；NMDAR信号通路活化直接诱导LTP，同时也能上调Ca2+和活化Ca2+/CaMKIIγ信号通路，最终形成CaMKIIγ、BDNF和NMDAR三者相互促进的回路，可能有多种miRNAs参与调节这一回路[17,19,44]。

2.miRNAs与神经可塑性

长期使用阿片类药物导致的树突棘和轴突棘数量或结构的改变，被认为参与了阿片耐受的形成。丝氨酸蛋白酶抑制剂-1 (serpin peptidase inhibitor clade I, Serpini1) 是一种生物体内可增加树突棘密度的丝氨酸蛋白酶活性调节剂，有研究发现调节其表达的miR-27a在吗啡耐受小鼠前额皮质内显著降低，与一般的miRNAs不同的是miR-27a在转录后水平正向调节Serpini1的翻译，长期注射吗啡时Serpini1表达减低进而使小鼠前额皮质内树突棘密度减小导致吗啡耐受[5]。

miR-133b被认为可促进神经元轴突突起的生成和调节神经可塑性[45]。有研究者利用体外培养的大鼠海马组织探究慢性吗啡处理对神经元分化的可能影响，提出吗啡激活MORs后通过ERK通路调节miR-133b的表达，发现miR-133b在海马神经元中表达下调，最终引起神经突触信号传导异常[45]。

神经分化因子1 (neurogenic differentiation 1, Neurod1) 是一种参与神经元发育分化的重要转录因子，活化的Neurod1可能有助于树突棘稳定性、成体神经发生、学习和记忆等[46]。有研究比较了吗啡和芬太尼通过结合MORs而影响Neurod1的机制差异性，发现二者均能通过抑制CaMKIIα活性来降低Neurod1的磷酸化水平（即活化），然而芬太尼还可以通过ERK通路抑制小鼠海马组织中miR-190的表达来增加Neurod1水平，因为miR-190在转录后水平负向调节神经分化因子1的表达；但吗啡却没有改变miR-190的表达，最终效应就是吗啡可降低Neurod1的总体活性水平，而芬太尼可将其维持在基础水平[46]。进一步的研究发现，吗啡比芬太尼具有更高的诱导小鼠药物耐受的能力，这可能与二者调节miR-190表达的差异性有关；并提出吗啡降低Neurod1的活性水平进而可能通过降低树突棘稳定性、抑制成体神经发生诱导小鼠镇痛耐受产生，过表达Neurod1可以使吗啡诱导耐受能力下降[47]。

此外，有报道称miR-124和miR-19b也靶向调节Neurod1的表达[46]。有证据表明，体外培养的人神经祖细胞在补充外源性miR-124后，神经元分化和谷氨酸转运体表达的水平提高[48]。另有研究表明小鼠发生炎性或病理性神经痛时，脑组织和脊髓中miR-124水平降低并引起小胶质细胞活化，导致持续性的痛觉过敏，鞘内注射miR-124可降低痛觉过敏程度[49]。鉴于吗啡耐受和痛觉过敏可能存在相似的发生机制[50]，例如小胶质细胞的活化，推测miR-124可能参与了镇痛耐受的发生。一项针对小鼠前额皮质的miRNAs表达谱分析显示，吗啡耐受后miR-19b水平下调[5]，但目前还未见到miR-19b参与调节伤害性传导通路的详细报道。

四、结语

阿片类药物通过激活MORs，一方面产生抑制性G蛋白信号而发挥镇痛作用；另一方面可活化ERK/CREB等信号通路引起多种miRNAs表达变化，继而导致MORs下调和神经适应等。miRNAs为揭示阿片耐受机制和防治阿片副作用提供了新的切入点，但也面临着诸多问题。首先，阿片类药物可以引起机体多种miRNAs上调或下调，这些miRNAs有的被证实参与了阿片耐受，有的可能发挥着调节镇痛等有益作用，有的可能介导了其他不利作用；不同阿片类药物调节miRNAs的能力存在差异性，此外还有明显的组织细胞表达差异，这就需要进一步鉴别出那些调节阿片耐受的代表性miRNAs。其次，一种miRNAs可以调节多种靶基因表达，而一种靶基因也可能受多种miRNAs调控。这种多样性使得在将miRNAs用于临床诊断和治疗时，不得不面对诊断特异性和治疗副作用等问题。此外，在研究将miRNAs作为防治阿片耐受的靶点时，还要考虑转运载体的选择，纳米粒、外泌体等可能是未来的研究方向。总而言之，miRNAs参与阿片耐受的机制是复杂的，把miRNAs作为干预阿片耐受的靶点还将面临着许多挑战。