瑞香素及噁唑类小分子抑制吲哚胺-2,3-双加氧酶1(IDO1)的研究

李 晟，李焱鑫，Emmanuel Mfotie Njoya，蒋 黎，李 霖*，王 飞*

1中国科学院成都生物研究所天然产物及临床转化重点实验室，成都 610041； 2四川省医学科学院 四川省人民医院检验医学研究所，成都 610072

吲哚胺-2,3-双加氧酶1(indoleamine 2,3-dioxygenase 1,IDO1)是广泛分布于肝脏以外，含亚铁血红素的单体蛋白质，能够催化色氨酸沿着犬尿氨酸途径(kynurenine pathway，KP)代谢的限速酶，可催化色氨酸分解产生L-犬尿氨酸、喹啉酸等具有生物活性的代谢产物[1]。IDO1由IDO1基因编码，IDO1基因启动子含有2个IFN-γ激活位点[2]，IFN-γ可以诱导IDO1高水平表达。有研究表明，IDO1在多数组织中处于沉默状态，但是在多种肿瘤细胞中高表达[3]，IDO1的过表达与癌症的发展和预后相关[4]，抑制IDO1活性在肿瘤疾病的治疗中有着举足轻重的作用，因此IDO1也被认为是一个具有极大开发潜力的靶标。

目前，已经进入抗肿瘤临床试验的IDO抑制剂主要包括INCB024360、NLG-919、1-甲基-色氨酸等[5]，但是现有抑制剂存在活性低、选择性差、分子骨架单一或毒副作用等缺点[6]，世界上还未有IDO1抑制剂药物问世。作为免疫治疗的热门靶点，IDO1抑制剂的类型和数量都处于一个很低的水平，IDO1及其抑制剂仍然有巨大的研究价值和应用前景。

瑞香素(Daphnetin)是从瑞香属植物长白瑞香(Daphne Korean Nakai)中提取出来的有效成分，又名祖师麻甲素，其为我国首创的新药，化学名为7,8-二羟基香豆素(7,8-dithydroxycoumarin)，为香豆素类化合物，主要存在于瑞香科属植物中。临床上瑞香素主要用于血栓闭塞性脉管炎、冠心病心绞痛、类风湿性关节炎等疾病[7]。近年来的研究发现，瑞香素也具有抗肿瘤作用[8]，但是其作用机制有待进一步的研究。另外，噁唑类小分子在天然产物和有机合成化合物中广泛存在，具有该基团的小分子表现出一系列重要的生物活性，包括抗肿瘤、抗真菌、抗炎和抗病毒等，受到了学界和业界的广泛关注[9]，但是该类化合物发挥其活性的作用靶点和机制还尚不清楚。本研究参考文献[10]报道的检测IDO1代谢色氨酸吸光光度法，利用HeLa细胞建立体外筛选IDO1小分子抑制剂模型，并通过过表达IDO1和Western blot等方法，评价筛选到的小分子化合物IDO1抑制活性。实验结果首次发现了瑞香素和ZH-26具有抑制IDO1的活性，不但为了解瑞香素这一天然来源临床药物的抗肿瘤机制提供新的视角，也为开发新的靶向IDO1的肿瘤免疫治疗候选药物奠定了基础。

1 实验材料

1.1 细胞和质粒

人宫颈癌细胞HeLa、人胚肾细胞HEK-293A购自中国科学院上海生命科学院细胞资源中心，由中国科学院成都生物研究所天然产物中心实验室保存；IDO cDNA购自北京义翘神州科技有限公司。

1.2 试剂

瑞香素(Daphnetin)购自上海源叶生物科技有限公司；Epacadostat购自上海蓝木化工有限公司；人干扰素IFN-γ购自南京金斯瑞生物科技有限公司；IDO1兔多抗、GAPDH兔多抗购自武汉三鹰生物技术有限公司；转染试剂LIPOFECTAMINE 2000购自赛默飞世尔科技公司；EasySeeWestern Blot Kit发光液购自北京全式金生物技术有限公司；增强型CCK-8试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.3 试剂

Verioskan Flash多功能读数仪(Thermo Fisher)；ImageQuantLAS500一体化成像仪(GE Healthcare)。

2 实验方法

2.1 细胞培养

人宫颈癌细胞HeLa、人胚肾细胞HEK-293A均在DMEM-高糖培养基(10%新生牛血清，100 U/mL氨苄青霉素及100 mg/mL链霉素)，5% CO2，37 ℃细胞培养箱中培养。

2.2 IDO1抑制剂筛选

HeLa细胞按1.0×105个/孔接种至48孔板，37 ℃培养过夜。每孔加入适量待测试药物，Epacadostat作为阳性对照药，培养24 h。每孔加入 50 ng/mL IFN-γ培养24 h以诱导细胞内IDO产生。取100 μL细胞培养液至离心管中，加入25 μL 30%的TCA，50 ℃水浴30 min，10 000 rpm离心10 min，取100 μL上清液至96孔板中，每孔加入100 μL 2%的对二甲氨基苯甲醛(PDAB)，混匀后室温静置10 min，多功能读数仪检测A492。

2.3 免疫印迹分析

HeLa细胞按1.0×106个/孔接种至6孔板，37 ℃培养过夜。每孔加入不同浓度瑞香素或ZH-26，Epacadostat作为阳性对照药，培养24 h。每孔加入 50 ng/mL IFN-γ培养24 h以诱导细胞内IDO产生。吸去培养基，PBS漂洗细胞3次，加入适量RIPA裂解液，冰浴30 min裂解细胞，用细胞刮刀将细胞刮下，12 000 rpm离心，收集上清液为蛋白提取液。加入5×loading buffer沸水浴5 min，制得蛋白样品。12% SDS-PAGE电泳分离蛋白，用半干法将蛋白转印至NC膜。转膜结束后，放入TBST配置的5% BSA中封闭2 h。封闭后膜与一抗(1∶1 000稀释)4 ℃孵育过夜，用TBST漂洗3次，与HRP标记的二抗(1∶5 000稀释)在室温孵育2 h后，TBST漂洗3次，按照EasySee Western Blot Kit发光液说明书进行显色，通过GE Health成像系统进行成像。

2.4 HEK-293A过表达IDO

HEK-293A细胞按1.0×106个/孔接种至6孔板，37 ℃培养过夜。在转染前2 h将培养液更换为无血清无双抗培养液。用125 μLOpti-MEM稀释2.5 μg IDO cDNA，另用125 μL Opti-MEM稀释5 μL LIPOFECTAMINE2000，轻轻混匀，室温静置5 min。将质粒稀释液滴加至稀释好的转染试剂中，室温静置20 min，将混合液滴加至6孔板中，37 ℃培养6 h更换为完全培养基，37 ℃继续培养24 h过表达IDO。

2.5 HeLa细胞增殖

HeLa细胞按5 000个/孔接种至96孔板，37 ℃培养过夜。加入不同浓度瑞香素或ZH-26，培养24 h，每孔加入10%增强型CCK-8溶液，在37 ℃继续培养0.5～1 h。当培养液颜色变黄时，多功能读数仪检测450 nm吸光度。

2.6 数据统计与处理

所有实验均重复三遍，结果表示为平均值±标准差，运用GraphPad Prism软件进行单因素方差分析(One way-ANOVA)，P<0.05为具有显著性差异。

3 实验结果

3.1 IDO1抑制剂筛选

通过以上建立的基于IFN-γ诱导HeLa细胞高表达IDO1模型，对本实验室771个化合物进行筛选，发现化合物瑞香素和ZH-26(图1)具有显著的IDO1活性抑制作用。

图1 化合物瑞香素和ZH-26的化学结构Fig.1 Chemical structures of daphnetin and ZH-26

用不同浓度的瑞香素和ZH-26检测对IFN-γ诱导的HeLa细胞表达IDO1酶抑制作用，采用GraphPad Prism软件对IC50值进行计算，结果如图2所示。其中瑞香素的IC50值为16.50 ± 0.33 μM，ZH-26的IC50值为4.68 ± 0.21 μM，说明这两个化合物在体外具有良好的IDO1酶抑制作用。

图2 瑞香素和ZH-26对IFN-γ诱导的HeLa细胞表达IDO1酶抑制的IC50值Fig.2 The IC50 value of daphnetin and ZH-26 inhibiting the expression of IDO1 in HeLa cells induced by IFN-γ

3.2 HEK-293A过表达IDO1

IDO1在肿瘤细胞中高表达，而在多数细胞之中处于沉默状态。在HEK-293A中过表达IDO1，检测瑞香素和ZH-26对IDO1酶的抑制作用。pCMV3-IDO1质粒转染至HEK-293A细胞24 h后，加入不同浓度的瑞香素和ZH-26处理6 h，细胞上清液检测IDO1活性，结果如图3所示，瑞香素和ZH-26均能够抑制过表达的IDO1酶活性，并且随着浓度增加该抑制作用加强。以上结果表明，瑞香素和ZH-26可以直接抑制IDO1的活性。

3.3 IDO1的免疫印迹

不同浓度的瑞香素和ZH-26处理HeLa细胞，Western blot检测IDO1蛋白的表达情况，结果如图4所示。50 ng/mL的IFN-γ可以促进IDO1蛋白显著表达，而瑞香素可以明显地抑制IFN-γ上调IDO1的作用，并且随着化合物浓度的增加，抑制作用越明显，但是ZH26则对IDO1的表达没明显的作用。以上结果表明，瑞香素抑制IDO1活性很有可能是通过下调IDO1的表达。

3.4 HeLa细胞增殖

为了排除化合物对HeLa细胞中IDO1的抑制活性是由于其细胞毒所导致，我们进一步分别用不同浓度的瑞香素和ZH-26处理HeLa细胞24 h，CCK-8检测化合物对HeLa细胞增殖的影响，结果如图5所示。在低浓度下，瑞香素和ZH-26对HeLa细胞均没有明显的细胞毒作用，表明在低浓度的条件下，化合物下调HeLa细胞的IDO1的表达并不是因为对细胞的毒性作用引起的。

图3 瑞香素和ZH-26在过表达细胞中抑制IDO1活性Fig.3 Daphnetin and ZH-26 inhibit IDO1activity in overexpressed cells

图4 瑞香素和ZH-26下调IDO1表达Fig.4 Daphnetin and ZH-26 down regulated the IDO1 expression

图5 瑞香素和ZH-26对HeLa细胞的增殖作用Fig.5 Inhibition of cell proliferation by daphnetin and ZH-26 in HeLa cells

4 结论

由于IDO1在肿瘤的发生转移以及肿瘤免疫耐受过程起到重要的作用，IDO1被证实是抑制恶性肿瘤形成，提高免疫治疗效果的重要靶点[11]，同时IDO1也与阿兹海默病、抑郁症等多种疾病的发病机制密切相关[12]，因此IDO1抑制剂的开发具有十分广阔的前景。

目前，已有大量关于IDO1抑制剂的相关报道，部分抑制剂进入了临床研究阶段，但仍存在活性低、选择性差、分子骨架单一或毒副作用等缺点。1-甲基色氨酸(1-MT)是一个以色氨酸为模板化学合成的IDO1竞争性抑制剂，其对IDO1的抑制活性并不高(Ki = 19～35 μM)[13]。INCB024360也是临床中运用的测试药，细胞测试其对IDO1的IC50为7.1 nM，不能抑制吲哚胺2，3-双加氧酶-2(Indoleamine 2,3-dioxygenase-2,IDO2)和色氨酸双加氧酶(tryptophan 2,3-dioxygenase,TDO)，但是INCB024360治疗癌症的同时也带来不小的毒副作用。天然产物是药物筛选的宝库，也是重要来源之一，针对天然产物的IDO1抑制剂筛选报道中，色胺酮的衍生物对IDO1有抑制活性(Ki50= 180 μM)[14]。基于荧光素酶报告基因筛选得到的川楝素(Toosendanin)可以下调IFN-γ诱导的肿瘤细胞IDO1表达，促进NK细胞对A549细胞的杀伤作用[15]。槲皮素(Quercetin)可能通过抑制IDO1活性，影响色氨酸代谢发挥抗肿瘤作用[16]。

促炎因子IFN-γ能够诱导HeLa细胞表达大量的内源性IDO，因而在细胞上清中可以检测到犬尿氨酸的含量变化。在HeLa细胞中，IFN-γ只能诱导IDO1的表达，不能诱导IDO2或TDO的表达[16]。以此建立了IDO1小分子抑制剂体外筛选模型，并在实验室化合物库中得到了天然小分子瑞香素和ZH-26两个具有潜在抑制IDO1活性的化合物[17]。其中，ZH-26与靶向基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMP)进入临床 I 期研究的抗肿瘤转移药物CGS 27023A的结构类似[18]。

本研究首次发现瑞香素和ZH-26可以直接抑制IDO1的活性，从而为基于香豆素类和噁唑类结构开展新型IDO1抑制剂的药物设计提供了药物前体，也为进一步了解其生物活性机制提供了新的思路。瑞香素过去也被发现是一种蛋白酶抑制剂，能够抑制EGFR、PKA和PKC[19]。因此，瑞香素可能通过抑制EGFR等蛋白激酶进而影响干扰素介导的JAK/STAT信号传导及IDO1表达。本研究发现瑞香素和ZH-26是新型高效的IDO1抑制剂，在体外可以下调IFN-γ诱导的IDO1表达或抑制IDO1的活性，不但为了解瑞香素这一临床药物的抗肿瘤机制提供新的视角，也为开发新的靶向IDO1的肿瘤免疫治疗候选药物奠定了基础。