脂肪干细胞促进脂肪移植血管化的研究进展

尹钰佳 顾婕妤 李东 袁捷

【提要】 自体脂肪移植时，其组织基质血管片段（Stromal vascular fraction，SVF）中存在脂肪干细胞（Adipose-derived stem cells，ADSC），具有强大的促血管化作用。本文对近年来有关ADSC促进脂肪移植血管化的研究进展进行综述，以期为ADSC促血管化作用在脂肪移植领域的应用提供新方向。

自体脂肪移植已广泛应用于先天畸形、外伤、肿瘤术后等造成的软组织缺损的修复，脂肪组织工程技术也受到缺血性疾病、糖尿病、肥胖等多疾病领域的关注。但是，脂肪组织具有特殊的组织结构和血供系统，移植后因血供不足而导致成活率低下，是一直备受关注的问题。成熟脂肪组织中仅有10%单房脂肪细胞如“葡萄串”样排列于血管支架上，却占据了90%的空间体积，其耗能高，血供要求高，而移植早期脂肪组织仅靠浸润和渗透维持营养供应[1-2]。因此，移植后所处微环境的血管化程度与移植脂肪成活率息息相关。ADSC被认为是一类来源于脂肪组织中血管基质成分的间充质干细胞，具有自我更新、多种分化潜能和强大的旁分泌功能。ADSC在脂肪移植中具有突出的促血管化作用，已被广泛应用于组织工程及临床各个领域。大量研究表明，脂肪移植前的预处理及脂肪移植中ADSC发挥的作用，均能有效促进血管化的程度，从而提高脂肪移植物存活率。本文对预处理及ADSC的促血管化作用的研究进展进行综述。

1 脂肪移植促血管化预处理

利用移植ADSC进行组织修复过程中，由于血管化程度不足或处于低氧环境，所得的脂肪体积常远小于移植物。然而，在脂肪移植前进行有效预处理可促进ADSC成血管化过程，提高移植成活率。就组织工程研究而言，在确定了种子细胞为ADSC的前提下，合适的三维支架和ADSC生长的微环境已经成为了ADSC移植预处理的主要方向。其中，微环境的改善可以通过联合其他细胞共培养、额外添加的生长因子和血小板、缺氧环境的改善以及一些物理手段等途径达到。

1.1 支架材料

支架材料可分为天然材料、人工合成材料以及脱细胞脂肪组织基质。良好的支架材料通常具有高表面积/体积比，有助于细胞的黏附、增殖、迁移和分化。脱细胞化生物支架去除了免疫组分细胞外基质，优点在于保留了天然的细胞增殖分化的微环境。同时，脱细胞脂肪组织基质经不同脱细胞方法获得后，组织特异性与诱导ADSC成脂分化的能力不变[3]。Duisit等[4]应用SDS/极性溶剂法进行灌注脱细胞并移植带血管蒂的人耳，获得良好的耐受性和抗炎性，证明了灌注脱细胞方法在组织移植方面的实际应用价值。

1.2 联合内皮细胞培养

人脂肪源性微血管内皮细胞 （Human adipose microvascular endothelial cells，HAMEC）和间充质干细胞（MSC）都已被证明具有血管生成能力。Pedersen等[5]将血管内皮细胞（Endothelial cells，EC）、MSC 与支架结合，以确保移植后的组织具有充分的氧气及高度血管化。Shandalov等[6-8]基于构建带有自身蒂的厚血管化组织的前期研究，在多孔生物降解聚合物中共同培养HAMEC和MSC作为移植体植入大鼠股骨血管周围，形成高血管化皮瓣，以治疗大面积全层软组织缺损。

1.3 生长因子

脂肪组织中各种细胞通过旁分泌多种细胞因子，如VEGF、bFGF、EGF、IGF-1、HGF、PDGF 等，促进移植脂肪的血管化。有研究对ADSC进行基因修饰，使其过表达VEGF，或在缺氧条件下预培养ADSC以诱导产生血管生成表型[9-10]。另外，在含 4种血管生成生长因子 （EGF、FGF-2、IGF-1和VEGF）的内皮生长培养基（EGM-2）中预培养ADSC的效果优于普通的内皮培养基或添加单种生长因子的培养基[11]。

1.4 血小板

血小板内含有大量的细胞因子、生长因子和信号分子，可在损伤部位释放，并促进组织修复、血管再生和分化。此外，血小板形成的纤维蛋白，即富含血小板的纤维蛋白（Platelet-rich fibrin，PRF）也可以成为 ECs生长的支架[12]。 因此，血小板的浓缩，如富含血小板的血浆（Platelet-rich plasma，PRP）和血小板裂解液，可提供更多的生长因子来达到治疗效果[13]。PRF可自然形成纤维蛋白支架，含有高浓度的白细胞，同时具有促进伤口愈合和防止感染的作用[14]。然而，ADSC的细胞活力和成脂分化能力与添加的血小板浓度密切相关，10%～20%的PRP起促进作用，而大于20%浓度的PRP则起抑制作用。此外，PRP的副产品缺乏血小板的血浆（Plateletpoor plasma，PPP）也能用于 ADSC 的扩增[15]。

1.5 缺氧环境

正常氧培养条件（21%氧）下的ADSC生长潜能低下，可能与ADSC生存条件（2%～8%氧）或体内缺血损伤所致氧化应激条件在氧合水平上的差异有关。缺氧预处理（2%氧）可以提高ADSC的生物活性和组织再生潜能，促进细胞增殖、迁移、血管生成，减少衰老和凋亡[16-17]，其机制可能与其促进血管生成和神经保护有关[18]。不同氧浓度对血管生长的影响不同，对不同成熟度的血管也会有不同影响。低氧抑制新生血管生长，却不影响成熟血管继续生长[19]。

1.6 其他

一些物理手段也可以作为ADSC移植的预处理方式。Yin等[20]证明体外冲击波联合ADSC的抗炎和促血管作用可以治疗股四头肌急性缺血再灌注损伤。Constantin等[21]利用CO2激光预照射ADSC增加其潜能。低水平光治疗，尤其是红光也可以提高ADSC的促血管化能力[22]。

2 ADSC在脂肪移植中成血管作用机制

2.1 ADSC通过分化作用促进血管网形成和稳定

ADSC作为间充质干细胞具有多能性，通过分化成为软骨细胞、骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞、平滑肌细胞等发挥作用，甚至可分化成为心肌细胞作用于心肌梗死小鼠模型恢复其部分心肌功能，增加左心室射血分数[23]。ADSC可直接或经自分泌和旁分泌作用间接分化成内皮细胞、平滑肌细胞、周细胞促进血管网的形成和稳定，提高脂肪移植成活率。体外培养基通过诱导ADSC向EC表型分化联合脂肪吸取物共同进行体内脂肪移植培养证实，EC联合培养较协同SVF片段移植具有更高的脂肪移植存活率、移植物形态完整性和更丰富的内皮细胞标志物CD31和vWF的表达[24]。

三种分化细胞间可通过信号通路互动调节，参与血管网的构建和稳定[25]：①内皮细胞通过TβR/ALK-1和TβR/ALK-5通路调节细胞增殖和分化，同时激活潜在TGF-β，促进壁细胞（血管平滑肌细胞和周细胞）分化；②壁细胞经Ang-1/Tie2通路促进内皮细胞稳定；③毛细血管出芽时内皮细胞迁移的顶端细胞合成并分泌PDGF-B同壁细胞上PDGFR-β结合，促进周细胞的增殖和迁移；④内皮细胞S1P/S1P1信号通路有利于召集壁细胞，促进血管稳定；⑤内皮细胞和壁细胞可通过不同的Notch信号通路形成各自的动静脉特性。

但Yuan等[26]提出，ADSC早期成血管化主要依赖分泌作用产生各种成血管因子，而不是其分化作用产生各具功能的细胞。一系列心肌梗死模型ADSC作用机制探查试验显示，ADSC以其旁分泌作用释放的细胞因子为重点达到保护心肌、血管化重构、治疗缺血性疾病的目的[27]。在ADSC和EC联合培养的3D模型中，两种细胞皆表达Wnt配体，且血管生成也受经典Wnt途径调节。β-连环蛋白在两种细胞内积累后完成核转位，这种核转位提高了核辅因子Lef-1和细胞周期蛋白D1的表达，同时也促进VEGF-A、bFGF、IGF-1等相关血管生成调节因子完成转录，Wnt途径由此调节以ADSCs介导的旁分泌信号[28]。

2.2 ADSC通过自分泌和旁分泌作用调控血管化过程

2.2.1 VEGF和ADSC

在脂肪移植中，VEGF在调节血管生成和淋巴管生成方面有决定性作用。在ADSC移植后的第7天，VEGF分泌显著增加，之后逐渐下降[29]。在缺氧情况下，VEGF分泌增加，同时其可诱导ADSC分化为内皮细胞，该途径受到受体酪氨酸激酶（RTKs）活性的影响[29-31]。

VEGF 家族包括 VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D以及胎盘生长因子，其中VEGF-A是主要的促血管生成因子，在促进移植物血管新生的初期作用最强。VEGF-A可与两种受体结合，即 VEGFR-1（Flt-1）和 VEGFR-2（KDR/Flk-1），并影响内皮细胞存活、增殖、迁移、分泌和调节血管渗透性[32-33]。VEGFR-2对促血管生成的信号可以产生很强的RTKs活性，而可溶的VEGFR-1（sFlt-1）却是一种内源性VEGF抑制因子[33]。虽然VEGFR属于PDGFR超基因家族，但不同于PDGFR家族的下游信号通路 PI3K-Akt，VEGFR主要利用 PLCγ-PKC-MAPK通路传递信号。除了直接调节其下游信号通路，VEGF-VEGFR还与其他血管生成调节系统协同调节血管生成，如 Ang-Tie和Delta（DLL4）-Notch 系统[33-34]。 而在缺血情况下，VEGFR-2/mTOR/Akt途径可被激活，此时mTOR和Akt经磷酸化可作为VEGF/VEGFR-2的下游靶标[35]。在糖尿病缺血性皮瓣成活率的研究中，HIF-1α/VEGF通路也作为缺血缺氧环境下重要的调节机制被广泛关注[36]。

2.2.2 bFGF与ADSC

bFGF通过调节RTKs的活性，可参与到ADSC分化为内皮细胞的诱导过程[29]，同时bFGF具有促进血管样结构形成的能力。Khan等[31]使用FGF受体阻断剂PD173074后，抑制了其在mRNA和蛋白质水平对于内皮型一氧化氮合酶（eNOS）的诱导激活作用，同时也使毛细管柱状结构的形成能力受到抑制。Hoseini等[37]将编码FGF-1的质粒转染到ADSC中进行移植培养，证明FGF-1具有促进脂肪移植中血管增殖和管形成的作用。另外，FGF过表达也可促进基质金属蛋白酶 1（MMP-1）介导的内皮细胞迁移[38]。

2.2.3 HGF与ADSC

HGF是一种特异的促内皮生长因子，主要由成纤维细胞分泌，具有促进内皮细胞分裂增殖，抑制凋亡的作用[39]。抑制ADSC中HGF的表达降低了内皮祖细胞和成熟内皮细胞的增殖和迁移过程，导致缺血组织的血管再生受到抑制[40]。HGF促进ADSC成血管化可能主要通过HGF/c-MET通路，增加细胞外基质中FGF-2的含量。在肿瘤生成的过程中，HGF/c-MET通路可介导VEGF靶向制剂拮抗作用并通过促血管化作用促进肿瘤生长[41-42]。早期研究发现，HGF可促进基质中FGF-2的释放，但不参与诱导FGF-2表达的过程[43]。近期Ding等[39]发现，肿瘤相关成纤维细胞产生的HGF可通过PI3K/AKT和ERK1/2信号通路促进肿瘤发生、血管生成拟态和嵌合血管的形成。

2.2.4 PDGFs与ADSC

PDGFs是由 PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D 等 4种配体构成的二聚体，在肿瘤生长、血管形成、胚胎发育和调节细胞迁移增殖等方面有重要作用。研究发现，仅有PDGFA、PDGF-C、PDGF-D、PDGF 受体 （PDGFRα 和 PDGFRβ）在ADSCs 中被表达[44]。

随着ADSC向脂肪谱系分化，PDGFRα表达下调，而PDGFRβ在促进ADSC成血管化过程中占据重要地位。PDGFRβ可抑制白色脂肪细胞分化，还可促进ASDC增殖、迁移、血管化，并增加其旁分泌作用[45]。此外，PDGF-A与ADSC上的PDGFRα结合后，通过 PI3K/AKT/eNOS途径，促进血管化，并促进伤口愈合[46]。内源性的PDGF-D通过线粒体电子传递系统产生ROS，并在体内调节ASDC的自分泌环，比PDGF-B具有更强的促有丝分裂作用[45]。

Lopatina等[47]的体外实验证明，PDGF还可促进HAMEC分泌细胞外囊泡，囊泡内携带c-kit和干细胞因子（SCF），MMP含量增加，可促进血管样结构的形成。

2.2.5 IGF-1与ADSC

IGF-1可由多种细胞产生，如血管平滑肌细胞、巨噬细胞、血小板等，在脂肪移植促进血管生成过程中，IGF-1主要发挥抗凋亡作用，并促进血管平滑肌细胞迁移。总结Lin等[48]研究可得出以下观点：①IGF-1可以促进微血管生成，上调内皮细胞中血管生成相关基因和蛋白质表达，如VEGF-A、TGF-β、FGF-1、α-SMA、MMP-2 和 MMP-9 的表达水平上调，同时也上调ADSCs中周细胞相关基因和蛋白质表达；②内皮细胞和ADSCs共同培养，可以增强IGF-1的促血管生成作用；③IGF-1与其相应的受体结合后，激活PI3K/Akt信号传导途径，并进一步诱导细胞增殖、分化和迁移。但Balaji等[49]研究却发现，IGF-1可能不会引起VEGF的直接上调，而是以其他方式影响血管生成过程，包括通过激活VEGF-2R和CD-147。此外，Haleagrahara等[50]在缺血性心肌应用领域的研究证实，IGF-1可以增加血管生成因子IL-8的表达和促进毛细血管发芽，增加心肌新生血管，从而保护缺血心肌。

2.2.6 Ang-1与ADSC

Ang-1是一种寡聚体分泌的糖蛋白，属于血管特异性生长因子，是促进血管生成和新生血管成熟的必要条件。脂肪移植中，Ang-1与酪氨酸激酶受体Tie-2结合后受体磷酸化，并激活多种信号传导途径，促进血管生成和内皮细胞增殖，维持血管静止和调节血管通透性；此外，Tie-2激活后还可以通过Akt通路激活eNOS，通过释放一氧化氮诱导小动脉舒张，调节血管阻力。当eNOS被抑制后，MAT.Ang-1可以改善血管通透性和组织灌注，并通过VE-钙黏蛋白起到稳定内皮屏障功能的作用[51]。

2.2.7 TGF-β与 ADSC

TGF-β在调节ADSC成血管化过程中起到双重作用。TGF-β调节内皮细胞的功能，对内皮细胞产生两种不同效应主要是通过两种信号传导途径间的平衡介导的：ALK1和ALK5。它们各自激活不同的下游Smad途径：①表达Smad1/5的ECs通过特异性TβR/ALK-1信号通路促进Ecs增殖和迁移；②相反，普遍表达Smad2/3的Ecs通过TβR/ALK-5信号通路则产生抑制的结果[32]。

2.2.8 SDF-1与ADSC

基质细胞衍生因子-1（SDF-1），也称为CXCL12，被认为是不同干细胞募集和迁移过程中最重要的趋化因子。ADSC衍生的SDF-1a在血管生成中具有至关重要的作用，主要由SDF-1/CXCR4轴和SDF-1/CXCR7轴介导。其中SDF-1/CXCR7的结合是ADSC增殖所必需的，而CXCR7也是SDF-1诱导的ADSC迁移所必需的，SDF-1/CXCR4轴却相对更多地参与调节ADSC的运动性，其中CXCR4是ADSC归巢的重要受体[52-53]。Xu等[54]通过向人乳腺脂肪来源的干细胞（HBASC）转染SDF-1的受体CXCR4证实，转染后ADSC募集内皮细胞的能力增强，移植物的血运重建加快，从而促进血管化，减少脂肪细胞凋亡。

2.2.9 MMPs与ADSC

MMPs可协助ADSCs通过重塑细胞外基质，调节血管生成。Song等[55]发现，将ADSC包埋在Ⅰ型胶原蛋白组成的3D水凝胶中并预培养7 d后，接种于顶部的单层人脐静脉内皮细胞（HUVEC）大量侵入水凝胶，证实MMPs通过水解基质蛋白并使基质重塑，起到促进血管发芽的作用。其中，MMP-1可以降解Ⅰ型纤维胶原蛋白；MMP-2可以暴露胶原中促血管生成整合素的隐蔽结合位点，并激活促血管生成因子，包括TGF-β；MMP-9可以降解基底膜和其他细胞外基质组分。除了分泌型MMPs，ADSC表达的MT-MMPs在促血管化中也起到重要作用。

2.2.10 瘦素与ADSC

脂肪组织不仅可以储存脂肪，还可以分泌瘦素、脂联素等内分泌激素。瘦素（Leptin）是一种循环激素，通过下丘脑对饱腹感和能量消耗的反馈来调节脂肪组织的质量。有研究显示，瘦素能调节血管通透性，并通过上调FGF-2和VEGF促进脂肪组织血管化[56]。Delle Monache等[57]提出，缺氧诱导后的ADSC中瘦素表达明显增加，并激活HIF-2α，上调Flt-1和Tie-1等促血管生成受体。

2.2.11 其他

胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）属于转化生长因子β超家族，对多种神经损伤具有潜在的神经保护作用。脂肪移植中，ADSC可分泌大量GNDF，通过Ret-1特异性受体传递到下游的信号通路，诱导信号转导和转录激活因子3（STAT3）的磷酸化，而STAT3在血管生成中起关键作用，此信号通路不依赖VEGF通路而产生促血管生成作用[58]。乳腺癌脂肪移植术后复发模型分析认为ADSC可分泌CXCL1/8，通过CXCR1/2信号通路促进HUVEC的迁移和管形成[59]。ADSC还通过产生CCL-20经COX2-PGE2轴产生抗炎、促新生血管形成和上皮重建的作用[60]。

2.3 ADSC通过释放囊泡/外泌体介导血管化信号传导通路

囊泡/外泌体是由细胞释放和质膜包被的小泡，通过装载携带RNAs、蛋白和脂质等，引发受体细胞下游信号通路，参与相邻或远距离细胞间的信息交流。研究表明，ADSC除去分化和分泌细胞因子的作用外，还可通过分泌囊泡/外泌体参与到血管化的信号传递通路中，从而促进内皮细胞增殖、迁移和管形成[61]：①促内皮细胞分化培养基预处理的ADSC囊泡数量显著上调，其通过携带miR-31作用于血管内皮细胞FIH1促进人HUVEC迁移和管形成，小鼠动脉环的微血管生长[62]；②ADSC外泌体携带miR-125a作用于内皮细胞，抑制DLL4（一种血管化抑制因子）以促进内皮细胞顶端细胞的构成介导血管化[63]；③应用高表达MiR-126的ADSC外泌体可显著促进心肌缺血性损伤微血管的形成和迁移，同时通过抑制凋亡、抗炎、抗纤溶作用保护心肌细胞[64]；④富含microRNA-181b-5p的ADSCs外泌体于缺氧缺葡萄糖的环境下抑制大脑微血管内皮细胞TRPM7的表达，增加HIF-1和VEGF的表达，下调MMP-3组织抑制剂的表达，促进内皮细胞迁移和管形成，治疗脑卒中[65]；⑤富含长段非编码RNA（lncRNA）MALAT1（Metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1）的外泌体通过增加FGF-2和bFGF表达，促进人表皮成纤维细胞迁移和血管化，有利于创伤愈合[66]；⑥缺氧诱导下的囊泡可通过VEGF/VEGF-R通路促进血管化[67]等。

3 ADSC在脂肪移植中促血管化作用的应用

ADSC具有来源丰富、微创、易获取、易扩展、免疫原性低、体外增值能力强、不存在伦理问题限制等优点，使其在骨骼和肌肉系统疾病、慢性损伤的修复、心血管系统疾病、泌尿系统疾病、自身免疫性疾病（如关节炎、结肠炎、自身免疫性糖尿病）等的治疗方面具有广泛的应用前景，但ADSC应用于临床还需要进行大量研究[68-70]。ADSC可通过上调调节性T细胞，促进外周血嵌合体形成，抑制同种异体免疫作用[71]，并能加快血管化早期建立，改善缺血再灌注损伤，使得同种异体ADSC移植也成为近年来临床研究的热点。Alofisel（Cx601）作为一种局部注射的同种异体脂肪源性干细胞悬浮液，经临床试验证明，具有治疗克罗恩病患者复杂性肛瘘的潜力，目前已被FDA批准上市[72]。将同种异体的正常大鼠ADSC应用于治疗糖尿病大鼠皮肤损伤取得了明显成效，但缺乏临床试验支持[73]。

ADSC的分化潜能使之在再生医学中的应用十分广泛，其旁分泌的各种因子（细胞因子、趋化因子和生长因子等）更是在组织工程研究中获得关注。ADSC作为干细胞的一员，因其强大的分化潜能、强旁分泌能力、强促血管化能力，使它正迅速成为脂肪工程细胞来源的金标准[74]。

4 结论和展望

综上所述，ADSC来源广泛，提取方便，具有稳定的增殖能力和低衰老率，已获得广泛应用。目前，移植成活率的问题主要取决于如何提高移植后的血管化，这是主要的研究方向和难点：①脂肪组织工程研究中，已从支架构造、种子细胞培养、微环境改善等多方面进行了尝试，然而还未得出完善的方案，具体如何组合各个影响因素、所用浓度剂量、作用方式等都要继续研究；②ADSC促血管化的机制并未完全阐明明确；③虽然ADSC在组织工程和各疾病领域都有着广泛的应用前景，但距离临床应用还存在一定的距离，需要深入研究。