血管平滑肌细胞/内皮细胞miRNA
——中医药干预PCI预后的新靶点

经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention，PCI)扩大了冠心病(coronary artery disease，CAD)治疗领域，但在不断解决问题的同时也带来了新的挑战。最初的单纯球囊血管成形术因冠状动脉的弹性回缩而具有较高的再次介入率[1]。金属裸支架(bare-metal stents，BMS)植入后血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)异常增殖和迁移引起新生内膜过度增生[2]，由此导致较高概率的支架内再狭窄(in-stent restenosis，ISR)及1年内再次血运重建[3]。药物洗脱支架(drug-eluting stents，DES)能够释放抗增殖药物，抑制细胞增殖和新生内膜增生，预防再狭窄，降低PCI术后靶病变血运重建率[4-5]，然而，又带来了晚期支架内血栓等问题[6]。这主要与支架上抗增殖药物的非选择性作用有关，其在高效抑制VSMCs增殖和迁移的同时也具有抑制血管再内皮化等相关副作用[7]。PCI术后血管损伤修复是个复杂的过程，诸多细胞参与其中，尤其是VSMCs和内皮细胞(endothelial cells，ECs)扮演着重要角色[8]。人类所有的基因中只有约2%负责蛋白质的产生，而那些从所谓的“非编码”基因组区域转录而来的RNA被称为非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)。miRNA是ncRNA中重要的一种，大量研究表明，其能够调控包括参与血管重塑的基因在内的大量基因的表达[9]。中医药具有多器官、多途径、多靶点调节的作用特点，而miRNA调控机体病理生理过程同样具有多种机制，通过中医药调控miRNA水平具有巨大的治疗潜力。本研究综述VSMCs及ECs中miRNA在血管重塑过程中的分子机制中的作用以及中医药对其干预作用。

1 VSMCs miRNA概述

成年动物中VSMCs主要表现为收缩和合成两种表型，在各种刺激下会发生转换，具有巨大的可塑性。近年来，研究发现，miRNA参与调控了VSMCs的表型转换，其功能失调与PCI术后ISR等多种血管阻塞性疾病有关[10]。在血管重塑期间，VSMCs从收缩表型转换到合成表型，大量的VSMCs在内膜中积累，并向中心积聚[11]。目前相关研究已证实了几种miRNA在VSMCs表型转换中的调控作用。

1.1 抑制VSMCs增殖的miRNA miRNA是重要的转录后调控因子，许多miRNA已经被证实参与调控多种疾病相关基因的表达。其中，miR-143和miR-145是血管发育和血管疾病中VSMCs表型转换的主要调节因子[12]。Elia等[13]研究表明，miR-145和miR-143基因簇会导致小鼠VSMCs不完全分化，在模型小鼠增殖的VSMCs中水平明显较低。其他研究也表明，过表达miR-145抑制了大鼠受损颈动脉中的VSMCs增殖和新生内膜形成[14]。多项研究均表明，miR-145/miR-143簇通过对多种靶基因的调控维持VSMCs的收缩表型。如miR-145通过抑制Kruppel样因子5(Kruppel-like factor 5，KLF-5)调节VSMCs分化标志物，导致细胞增殖和迁移显著减少[14]。Quintavalle等[15]发现miR-145和miR-143直接以PKC-ε、PDGF受体α(PDGF-Rα)和肌成束蛋白(Fascin)为靶标控制VSMCs小体形成。Cordes等[12]报道Kruppel样因子4(Kruppel-like factor 4，KLF-4)和ELK-1(ETS癌基因家族成员)也分别是miR-145和miR-143的靶基因。此外，血液中miR-143的水平能够预测外周动脉闭塞性疾病或CAD病人的支架内再狭窄[16-17]，这些临床证据进一步证明miR-143/miR-145簇是新生内膜形成的分子机制中的重要一环。

除miR-145和miR-143外，miR-22也在VSMCs分化中起关键作用。在最近的一项研究中，Yang等[18]表明miR-22在受损的股动脉中水平下调，其主要靶向调控甲基CpG结合蛋白2(MECP2)、组蛋白去乙酰化酶4(HDAC4)和亲嗜性病毒整合位点1蛋白同源物(EVI1)的3'UTR区；通过功能获得或功能丧失体内实验，证明过表达miR-22抑制了VSMCs增殖以及损伤股动脉中的新生内膜形成，低表达则得到了相反的结果。

Torella等[10]在球囊损伤的大鼠颈动脉中观察到miR-133水平较对照组明显降低。腺病毒介导的miR-133过表达减少了球囊损伤后的新生内膜形成，低表达结果也从反面加以证实；进一步实验发现miR-133主要通过靶向调控转录因子Sp-1和Moesin，抑制VSMCs的增殖和迁移。临床研究也表明介入术后低miR-133a浓度水平预示了更高的ISR靶病变血运重建率[19]。

调节VSMCs生理功能和血管再狭窄的其他重要miRNA还包括miR-195。研究表明miR-195通过靶向调控Cdc42、细胞周期蛋白D1和成纤维细胞生长因子1(fibroblast growth factor 1，FGF1)抑制VSMCs的增殖、迁移和促炎生物标志物的表达，而氧化低密度脂蛋白(oxLDL)能够降低miR-195水平[20]。此外，miR-195过表达能够抑制大鼠颈动脉损伤后内膜增厚[20]。外周动脉疾病病人行支架植入术后，循环miR-195水平被证明是其2年后靶血管血运重建的独立预测因子[21]。

相关研究也发现，其他miRNA参与调节VSMCs的表型转换。miR-23b通过直接调节尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinase-type plasminogen activator，uPA)，SMAD家族成员3(SMAD3)和FoxO4来抑制VSMCs的增殖和迁移，过表达miR-23b可显著降低损伤诱导的新生内膜形成[22]。miR-125a-5p水平在增殖的VSMCs中较低，其负向调节血小板衍生生长因子-BB(platelet-derived growth factor-BB，PDGF-BB)介导细胞的迁移和生长[23]。据报道，miR-663通过靶向调控JunB和肌球蛋白轻链9(MLC9)负调节VSMCs的迁移及其分化标记基因在人体中的表达。此外，miR-663的过表达减少了小鼠颈动脉结扎引起的血管损伤后新生内膜病变的形成[24]。

1.2 促进VSMCs增殖的miRNA Ji等[25]实验表明,miR-21通过直接靶向调控VSMCs的关键调节因子磷酸酶与张力蛋白同源物基因(phosphatase and tensin homolog，PTEN)促进VSMCs增殖，进一步研究表明，向受损动脉递送抗miR-21的反义寡核苷酸可以抑制大鼠的新生内膜形成。相关动物实验构建ISR模型，最终结果也都证明了miR-21在调节血管对损伤反应中的重要性。McDonald等[26]研究表明miR-21基因消融减少了小鼠血管支架植入后血管炎症和重塑。Wang等[27]使用抗miR-21涂层支架测试了局部递送miR-21抑制剂对损伤动脉的影响，结果表明这种方法能够显著降低ISR而不影响再内皮化。He等[17]报道，经过血管造影结果判定的再狭窄病人与对照组相比，miR-21循环水平明显升高，证明miR-21在人体中也起到重要的调节作用。

血管再狭窄中上调的miRNA还包括miR-221和miR-222[28]。这两种miRNA都能够促进VSMCs的增殖，其作用部分是通过抑制靶基因p27(Kip1)和p57(Kip2)来实现的。敲低miR-221和miR-222抑制了大鼠血管成形术后颈动脉的新生内膜增生[28]。最近还有研究报道，糖尿病小鼠动脉和VSMCs中miR-221和miR-222的水平增加，抑制这两种miRNA能阻止糖尿病动脉损伤后VSMCs异常增殖[29]。

miR-31的表达水平在损伤的大鼠颈动脉中显著增加[30]。大型肿瘤抑制因子2(large tumor suppressor homolog 2，LATS2)通过多种机制抑制细胞生长，而miR-31通过下调LATS2促进VSMCs增殖[30]。此外，miR-31通过下调E1A激活基因阻遏子(cellular repressor of E1A-stimulated genes，CREG)水平，促进人VSMCs转向合成表型[31]。有研究表明，miR-146a通过靶向KLF4正调节VSMCs的合成表型，过表达miR-146a增加VSMCs增殖，而抑制其在受损大鼠颈动脉中的表达能减少新生内膜增生[32]。Sun等[33]评估了miR-206在VSMCs表型转换中的作用，研究表明其在受损血管壁的增殖性VSMCs中的表达显著增加；相反，慢病毒介导的miR-206抑制减少了球囊损伤后的新生内膜形成。miR-181b通过激活磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路促进VSMCs的增殖和迁移，抑制内源性miR-181b水平能够抑制血管成形术后大鼠颈动脉的新生内膜增生[34]。

2 ECs miRNA概述

内皮功能对维持血管生理机能和改善支架植入术后远期预后至关重要。PCI术植入支架后会导致血液剪切应力改变，而ECs能调节血管对剪切应力变化的反应，并且支架术后腔内单层ECs的快速再生对于预防再狭窄和支架内血栓具有重要意义[35]。ECs中表达最高的miRNA是miR-126，其在炎症反应和内皮功能障碍中扮演了重要角色，缺失会影响受损动脉中的ECs再生，并导致小鼠血管完整性丧失和血管新生减少[36]。miR-126通过抑制蛋白SPRED-1和PIK3R激酶以及炎性细胞因子血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)调节ECs中两种主要信号通路-血管内皮生长因子(VEGF)通路和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)通路[36]。miR-126也调节ECs对脂质的反应，并通过调节ECs周转来发挥保护作用[37]。此外，其通过调控活化的白细胞黏附分子(ALCAM)和SetD5来阻止白细胞的黏附，减少单核细胞向被ox-LDL损伤的ECs聚集，以此抑制PI3K/苏氨酸蛋白激酶(Akt)/核转录因子(NF-κB)通路的激活[38-39]。尽管其生物学功能尚未完全阐明，但低水平的miR-126与急性心肌梗死、心力衰竭以及CAD等多种心血管疾病有关[40]。

miR-17/92a簇是CAD中的另一个关键调节因子，无论是在缺血和血管损伤的大鼠、小鼠模型中，还是在冠状动脉搭桥手术后处于运动恢复期间的病人中都能看到其水平上调[41]。miR-92a具有负向调控血管内皮生长的功能；抑制其表达会导致ECs增殖和迁移增加，并促进血管内皮修复[42]。相关研究表明，其通过调控整合素-A5(integrin-A5，ITGA5)减少血管成形术模型大鼠的再狭窄[41]。在股动脉损伤模型小鼠中，抑制miR-92a能加速损伤血管再内皮化，预防新生内膜过度增生，这与其被抑制导致的ITGA5和沉默信息调节因子1(SIRT1)表达水平增加有关[43]。miR-92a在动脉粥样硬化易感区域分离的ECs中的表达更高，可能是由于其通过微调KLF-2和KLF-4发挥部分促动脉粥样硬化作用[44]。同时，miR-92a还有调节内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)的作用，eNOS负责产生的NO具有抗动脉粥样硬化特性，进一步证实了其在该过程中的关键作用[45]。

miR-221/222也是参与调节ECs产生NO的重要miRNA之一[46]，其在ECs和VSMCs中发挥着明显不同的特异性调节机制，对ECs的作用主要是抑制增殖和迁移，这种机制在血管病理生理中发挥着关键作用[47]。有研究表明，miR-222参与了细胞间交流，其通过内皮细胞外泌体的转运来远程调节细胞内黏附分子1(intracellular adhesion molecule 1，ICAM-1)的表达[48]。最近的临床研究观察到阿托伐他汀能下调CAD病人内皮祖细胞中miR-221/222的表达，并且与低密度脂蛋白(LDL)水平正相关，表明其参与了他汀类药物降脂机制[49]。另外，miR-221/222还通过多种途径参与了ECs凋亡、促动脉粥样硬化以及血管新生等病理过程的调控[50]。

miR-21在发育、炎症和心血管疾病等过程中发挥着至关重要的作用[51]。在ECs中，miR-21通过靶向调控PTEN、SMAD7、Ⅰ型和Ⅴ型胶原以及蛋白多糖的表达调控血管新生[52]。此外，miR-21的表达受到单向和振荡剪切力的调节，并根据具体刺激的不同，其作用可表现为促进eNOS磷酸化、NO产生或者抑制过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPAR-α)表达[53-54]。最近，有研究小组的结果表明高水平的miR-16通过抑制RhoGDIα并降低NO生物利用度，造成后肢缺血模型小鼠内皮修复不良，甚至加重血管损伤反应[55]。miR-16通过调控VEGF、VEGF受体-2(VEGFR2)和成纤维细胞生长因子受体-1(FGFR1)来抑制体外ECs的增殖和迁移，同时还会损害体循环中促血管新生细胞的功能[56]。因miR-16水平与再狭窄风险呈正相关，许多研究者也将其视为肢体血管严重狭窄病人预后的可能生物标志物[57]。

3 中医药对VSMCs、ECs中miRNA的干预作用

miRNA主要参与调节体内细胞分化、凋亡、增殖等诸多生物学过程。在植物中普遍存在miRNA，中药来源的miRNA可以通过日常摄食的方式进入人体血液和组织器官，调控人体靶基因表达，进而影响人体生理功能，中药中miRNA可能是中药作用的有效成分和物质基础[58]。中医药能通过调控miRNA水平特异性调控ECs和VSMCs的增殖分化。有研究表明，黄芪甲苷可通过调节miR-21的表达，进而影响Akt相关信号转导通路，促进细胞增殖及血管新生[59]。丹皮酚能够减轻ox-LDL诱导的血管ECs氧化应激损伤，其主要机制可能是通过下调miR-21的表达水平来提高PTEN的表达，从而抑制p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)通路的磷酸化；上调损伤的miRNA-126水平，从而抑制PI3K/Akt/NF-κB通路，减少VCAM-1的释放，阻止单核细胞向ECs黏附[60-61]。结扎SD大鼠前降支构建心肌梗死模型，结果发现丹参多酚酸盐可升高心肌梗死边缘区miRNA-126表达水平，促进血管新生[62]。将当归补血汤的有效成分制成控释微囊，结果表明当归补血微囊可增强人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的活力，促进其增殖，并上调miR-21的表达水平，从而促进内皮细胞分裂增殖，诱导血管新生[63]。白藜芦醇(resveratrol)是虎杖等中药材的活性成分，有研究显示其可通过抑制miR-138的表达来抑制在db/db小鼠VSMCs中被高糖所诱导的NF-κB表达的上调，从而抑制db/db小鼠VSMCs的增殖和移行[64]。通心络在体内和体外均能抑制VSMCs的增殖和迁移，并能逆转miR-29a对VSMCs的促增殖和迁移作用[65]。

4 小 结

miRNA作为一种重要的ncRNA在VSMCs和ECs中均有较高的存在水平，主要通过调节靶基因表达来调控两种细胞的增殖和迁移等活动。PCI术后的损伤修复过程极其复杂，也是减少ISR以及改善病人预后的重点关注环节，而VSMCs和ECs是其中的关键因素。虽然介入技术不断发展，手术器械日新月异，但目前仍没有有效手段去解决促进内皮细胞增殖修复与抑制平滑肌细胞过度增生之间的矛盾。目前的一些研究发现内皮细胞与平滑肌细胞之间通过外泌体交流，而外泌体中发挥重要作用的是miRNA。同时部分miRNA在VSMCs和ECs中发挥着不同的调控作用，这就为探究PCI术后损伤修复问题提供了一个新的研究思路—靶向调控某一种或某几种miRNA的表达水平，在促进EC增殖迁移以加快内皮修复的同时抑制VSMCs过度增殖，减少再狭窄[66]。另外，中医药是我国传统文化的瑰宝，既往的临床研究已表明其在干预PCI术后并发症等方面具有积极的作用，实验研究也证明了其对VSMCs和ECs的调控作用[67]。中医药可能通过多靶点、双向调节miRNA水平来发挥其特异性调控VSMCs和ECs的功能。目前，已有部分研究表明中医药能够调节miRNA水平，仍需要更多的临床与基础实验去探讨中医药对miRNA的调控机制，促进中医药在干预PCI术后并发症等方面发挥更大作用。