细胞焦亡的研究进展①

靳胜男 安鼎杰 康元环 张 蕾 单晓枫 钱爱东

(吉林农业大学动物科学技术学院，长春 130118)

细胞焦亡(Pyroptosis)是依赖caspase-1、4、5、11介导的一种程序性细胞死亡，caspase-1、4、5、11是一类促炎性半胱氨酸蛋白酶，均属于半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)家族。相关研究表明，该家族中大部分的非炎性蛋白酶、如caspase-3、7、9等主要参与细胞凋亡，而部分炎性蛋白酶如caspase-1、4、5、11主要参与细胞焦亡，该类蛋白酶是机体产生炎症反应和先天免疫反应的关键所在[1]。目前，激活caspase-1和caspase-4、5、11所引发的细胞焦亡，被认为是宿主抵抗感染的辅助免疫防御机制。相关文献报道，被志贺菌、鼠伤寒沙门菌、李斯特菌、HIV病毒、登革热病毒、腺病毒等感染的巨噬细胞中均存在细胞焦亡。此外，在动脉粥样硬化、阿尔茨海默症、痛风性关节炎等相关疾病中也发现有细胞焦亡的参与。因此，本文针对目前由细菌或病毒等感染所引发的细胞焦亡的机制和细胞焦亡在相关疾病中的研究进展做以下综述，希望能够为后续细胞焦亡的研究提供帮助。

1 细胞焦亡的典型特征

细胞死亡有程序性和非程序性之分，程序性细胞死亡包括细胞凋亡、细胞焦亡等。其中，细胞凋亡是生理性主动自发的程序性细胞死亡方式，细胞焦亡是高度炎症性的程序性细胞死亡方式。细胞焦亡与细胞凋亡在特征上具有一定的相似性，但细胞焦亡的死亡过程又有别于细胞凋亡。具体区别如下：①发生焦亡的细胞逐渐膨胀，而后细胞核逐渐变圆且出现轻度的核浓缩，随着焦亡的发生，染色体DNA出现降解且在末端脱氧核苷酸转移酶介导的生物素脱氧尿嘧啶核苷酸缺口末端标记法(TUNEL)测定中显示阳性，在凋亡细胞中也有相似的情况出现；②焦亡细胞的DNA降解程度和TUNEL染色强度没有细胞凋亡中的高且有少量的梯带状DNA存在；③发生焦亡的细胞其细胞核的完整性是保持不变的，同时在细胞核周围形成球形囊泡[2]，这种形态特征是与凋亡不同的；而两者之间最大的不同是，在细胞焦亡期间，细胞丧失了质膜的完整性，细胞膜失去了调控物质进出的能力并迅速膨胀，最终导致细胞膜溶解，细胞发生渗透性崩解，同时释放出大量的炎症细胞因子IL-1β和IL-18到细胞外环境，并对邻近细胞产生促炎信号，募集到更多的炎症细胞，继而诱发炎症反应[3]，但发生凋亡的细胞，其细胞膜的完整性保持不变且不会发生炎症反应。另有研究表明焦亡细胞质膜的破裂与Gasdmin D蛋白密切相关，caspase-1或-11能够切割Gasdmin D的接头结构，释放Gasdmin-N端结构域，然后其与质膜的内部小叶相结合发生寡聚化，在细胞膜上形成1～2 nm的孔隙[4]，从而增大了细胞膜的通透性，钾离子外流、钠离子和水内流，导致细胞的离子梯度消失，细胞内渗透压增加，细胞膜失去了调控物质进出的能力，迅速膨胀，最终导致细胞膜溶解，细胞发生渗透性崩解。

2 细胞焦亡的分子机制

2.1经典细胞焦亡途径分子机制 经典细胞焦亡主要依赖于由炎性体激活的caspase-1，当病原体入侵宿主细胞时，细胞表面或内部的特异性模式识别受体(Pattern recognition receptors,PRRs)包括NOD 样受体(NLR)、Toll 样受体(TLR)、RIG 样受体(RLH)和C型血凝素受体(CLR)，这些模式识别受体能够识别病毒的核酸、细菌的细胞壁成分等病原体相关分子模式(PAMP)结构和内源性危险相关分子模式(DAMP)。模式识别受体与特定配体结合，再与其他蛋白结合形成多聚体蛋白复合物炎性体(Pyroptosomes)，炎性体中存在caspase的激活和募集结构域(CARD)或下游信号传导PYD结构域，不同炎性体分别对不同程度的危险刺激产生应答。目前，有关NLR蛋白家族报道日益增多，NLRP1炎性体由炭疽致死毒素激活[5]；NLRC4(或IPAF)炎性体由鼠伤寒沙门菌等其他细菌的鞭毛蛋白、Ⅲ型分泌系统(T3SS)中的组分激活[6]；AIM2炎性体则可结合李斯特菌和DNA病毒的胞质双链DNA而被激活[7]；Pyrinin 炎性体间接识别感染宿主细胞的病原体和宿主细胞Rho 家族中小G蛋白酶的修饰和失活[8]；NLRP3炎性体在真菌、细菌和病毒以及溶酶体、ATP等一系列激动剂作用下被激活，NLRP3配体能够刺激真核细胞产生活性氧(ROS)并使溶酶体损伤进而释放溶酶体蛋白酶，ROS和溶酶体蛋白酶可介导NLRP3活化[9]，此外，胞外ATP结合细胞膜上P2X7受体也可激活NLRP3，活化后的NLRP3激活caspase-1。对于仅含有PYD结构域的炎性体，可通过PYD结构域与凋亡相关蛋白ASC接头蛋白的N端PYD同源区域结合，激活ASC蛋白，募集半胱氨酸蛋白酶-1前体(pro-caspase-1)，随后，pro-caspase-1的N端CARD结构区域与ASC的C端caspase募集区域相互结合，最终使pro-caspase-1自身发生寡聚化，使无生物活性的pro-caspase-1形成具有活性的caspase-1，进而产生炎症反应。对于自身含有CARD结构域的NLRP1、NLRC4等可直接与pro-caspase-1相互作用，形成具有活性的caspase-1，诱导细胞焦亡。

2.2非经典细胞焦亡途径分子机制 非经典细胞焦亡是以激活caspase-4、5、11为前提的非经典途径。人源caspase-4、5与鼠源caspase-11具有同源性，并表现出相同的功能[10]，但在人类细胞中发生细胞焦亡的非经典炎症通路，需要进一步的研究来阐明。鼠源caspase-11可直接检测胞壁脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)。LPS组分中酰化脂质A部分与caspase-11的CARD结构域结合促进其自身寡聚化和活化，活化的caspase-11直接触发细胞焦亡[11]。此外，在LPS与caspase-11特异性结合后，激活的caspase-11可剪切修饰缝隙连接蛋白1(Pannexin-1)跨膜通道，促进Pannexin-1活化，使胞内的ATP即宿主细胞在细菌感染或受损下释放危险信号分子流出，释放ATP与细胞膜上P2X7受体结合，打开非选择性P2X7阳性离子通道，继而胞内的K+外流，胞外的 Na+和Ca2+内流，细胞膜完整性受损，导致胞内炎性内容物释放，引发炎症反应，细胞死亡[12]。因此，由LPS结合caspase-11引发的细胞焦亡非经典途径是经ATP介导的P2X7信号通路发生的，而Pannexin-1是介导该通路的必需物质。另一方面，PAMPs和DAMPs作用于Toll样受体激活TLR4信号通路，继而促进转录因子NF-κB的激活，NF-κB介导了促炎细胞因子IL-1β、IL-18前体的表达[13]，IL-1β、IL-18前体受到活化caspase-1的有效切割，形成成熟的IL-1β、IL-18释放到细胞外环境中[14]，同时，胞质内容物如HMGB-1、IL-1α、ATP也随之释放出来，诱导发生炎症反应。

相关研究报道，由 caspase-11介导的非经典焦亡途径中发现也有caspase-1参与其中，虽然caspase-1和caspase-11都诱导细胞焦亡，但caspase-11不能直接介导促炎因子IL-1β和1L-18的成熟[15]。在非经典焦亡中，由于Pannexin-1跨膜通道的打开，释放出的ATP能够激活炎性体NLRP3，NLRP3蛋白和接头蛋白ASC直接介导caspase-1的活化，其他炎性体如NLRC4或AIM2又可直接促进caspase-1的活化[16]，释放出促炎因子IL-1β和1L-18，触发细胞焦亡。caspase-11的活化不需要NLRP3蛋白和接头蛋白ASC的参与，因此，宿主细胞在细菌或病毒感染下，经典炎性体NLRP3、NLRC4或AIM2可直接结合caspase-1并作用于caspase-11启动的上游机制中[17]。尽管控制细胞焦亡通路在最近几年都有研究，但主要信号通路还是未知的，然而诱导细胞死亡的通路越多越有利于机体抵抗微生物对宿主的免疫逃避和损伤组织的修复以及相关疾病的治愈。

2.3Gasdermin D细胞焦亡的关键蛋白 最新研究发现Gasdermin D是caspase-1、4、5、11的共有底物，Gasdermin D是触发细胞焦亡的关键执行者[18]。Gasdermin D是Gasdermin结构域蛋白家族的成员，该蛋白家族是一种保守蛋白质家族，其中还包括Gasdermin A、B、C、DFNB59等[19]。相关研究报道表明，Gasdermin D是一类成孔蛋白，而该家族的其他成员是否与Gasdermin D具有相似的功能还需要进一步发掘与探究[4]。

Gasdermin D是双链蛋白并在免疫细胞和肠上皮细胞中表达。Gasdermin D的结构由两种结构域组成，分别为具有成孔活性的Gasdermin D氨基末端(Gasdermin-N)结构域和具有自动抑制Gasdermin-N活性的羧基末端(Gasdermin-C)结构域。Gasdermin D自身不具有活性，在细胞受到感染期间，通过活化的caspase-1和caspase-4、5、11特异性切割Gasdermin-N和Gasdermin-C结构域之间的接头结构，这时C-末端留在细胞质中，N-末端被释放，然后N-末端结构域选择性的与磷脂酰肌醇磷酸盐、磷脂酰丝氨酸(限于细胞膜内小叶)的心磷脂(细胞膜内外小叶)相结合，Gasdermin-N插入细胞膜脂质双层，并在膜内诱导发生寡聚化形成直径大约为10～15 nm的孔道[20]，致使一类小分子物质如7-氨基放线菌素、溴化乙锭等可以自由穿梭细胞膜内外，从而导致细胞膜渗透压被破坏，细胞肿胀，细胞膜溶解，IL-1β(4.5 nm)和IL-18(5.0 nm)快速流出并募集更多免疫细胞到感染部位[21]，阻止细胞内病原体的复制。在细胞焦亡期间，Gasdermin D 孔隙的形成起到了关键性的作用，其作用机制可能为今后相关疾病的药物开发提供了一条新途径。

3 细胞焦亡与相关疾病

3.1细菌性疾病

3.1.1志贺杆菌病 在志贺杆菌病中，志贺杆菌通过侵入结肠黏膜，引发急性炎症。1992年，Zychlinsky课题组通过福氏志贺菌感染鼠巨噬细胞检测该种病原菌诱导细胞死亡的能力[22]，结果发现，福氏志贺菌感染巨噬细胞能够诱发细胞发生程序性死亡，起初研究人员认为这种死亡方式是细胞凋亡。之后，Hilbi等[23]在福氏志贺菌感染鼠巨噬细胞过程中发现志贺菌的Ⅲ型分泌系统组分效应蛋白IpaB可以与caspase-1结合进而激活caspase-1，活化的caspase-1切割IL-1β诱导细胞死亡。随后该课题组利用caspase阻断剂YVAD抑制caspase活性后发现，caspase-1失活能够抑制志贺菌诱导的细胞死亡。为进一步证实caspase-1在此过程中的作用，该研究团队利用志贺菌分别感染caspase-1基因缺失和caspase-3基因缺失的小鼠巨噬细胞，结果发现，志贺菌不会引起caspase-1基因缺失型小鼠的巨噬细胞死亡，但在caspase-3基因缺失型小鼠中该病原菌可以致小鼠巨噬细胞死亡。在该过程中证实了志贺菌诱导了一种独特的细胞死亡方式，它依赖于caspase-1，不需要caspase-3参与。随后，相关文献报道IpaB是在炎性体IPAF作用下被激活，之后IpaB与caspase-1相互结合，使IpaB自身低聚化并插入细胞膜中，进而在细胞膜上形成选择性的阳性离子通道，致使细胞膜发生溶解，炎症细胞因子流出，引发炎症反应[24]。这些研究结果为细胞焦亡机制奠定了理论基础。

3.1.2鼠伤寒沙门菌引发的急性胃肠炎 鼠伤寒沙门菌是引起急性胃肠炎的主要病原菌之一,能够侵入宿主巨噬细胞并诱导caspase-1程序性细胞死亡。鼠伤寒沙门菌感染的巨噬细胞能够产生成熟的IL-1β、IL-18，而引起炎症反应。2001年，Cookson等[25]首次用术语“pyroptosis”来描述这种依赖caspase-1的促炎程序性细胞死亡方式。2008年，研究学者在鼠伤寒沙门菌感染鼠巨噬细胞的实验中发现细胞焦亡具有的特征，如DNA裂解，细胞膜上形成直径为1.1～2.4 nm的膜孔、细胞膜渗透性裂解的[26]。此外，相关文献报道称caspase-1介导的细胞焦亡是由不同的激活途径所引发的，炎性体NLRC4和NLRP3的独立途径均能激活caspase-1对沙门菌产生应答，NLRC4可以通过识别鼠伤寒沙门氏菌的鞭毛蛋白和Ⅲ型分泌系统的组分蛋白PrgJ来激活caspase-1；而NLRP3被激动剂ATP、柠檬酸等激活并与caspase-1相互作用；另外，LPS则可直接作用于caspase-11致使细胞发生，但此过程不需要NLRC4和NLRP3的参与[27]。

3.1.3李斯特菌引发的脑膜炎 人感染李斯特菌可引起致死性的脑膜炎，孕妇流产和新生儿细菌性脑炎。李斯特菌从巨噬细胞的吞噬体中逃脱，并在细胞质内复制发挥其致病作用。2008年，Warren等[28]研究证实在李斯特菌感染巨噬细胞中，caspase-1可通过IPAF识别李斯特菌鞭毛蛋白、NLRP3和衔接蛋白ASC传导信号三种途径被激活，致使IL-1β和IL-18成熟释放。2010年，Wu等[29]发现鞭毛蛋白缺陷型李斯特菌又可被AIM2炎性体识别，而诱导细胞焦亡。总之，李斯特菌感染是由多个炎性体对其应答，这些炎性体共同作用引起caspase-1活化和炎症反应。

3.2病毒性疾病

3.2.1艾滋病 艾滋病是由人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency virus,HIV)通过感染人单核巨噬细胞、树突状细胞、T淋巴细胞等带有CD4分子的免疫细胞而引起的慢性疾病。CD4 T细胞是HIV病毒感染的主要细胞靶点。在HIV 感染人淋巴细胞期间，CD4 T细胞死亡与caspase-3介导的细胞凋亡有关，并在相关研究中得到证实[30,31]。但是在2010年，Calloway等[32]经研究发现只有一小部分的CD4 T细胞是经HIV增殖性感染后，引发细胞凋亡而死亡；其余95% 处于静息状态的CD4 T细胞，在经HIV顿挫感染后，胞内不断累积病毒不完整的cDNA，并被干扰素诱导蛋白16(IFI16)所识别，进而导致炎性体的组装，caspase-1被激活，最后引发细胞焦亡而死亡。2015年，相关研究人员表明在HIV感染期间，HIV病毒离子在细胞与细胞之间的传递，是引起caspase-1依赖性的细胞焦亡的主要传播方式[33]。对于HIV患者来说，抑制淋巴组织中CD4 T细胞焦亡的产生，可提高针对宿主而不是病毒的新型“抗艾滋病”疗法的可能性，并且这也许会是一种非常有潜力的辅助治疗策略。

3.2.2登革热出血和登革休克综合症 登革热出血(DHF)和登革休克综合症(DSS)是由登革热病毒感染所引起的急性传染病。虽然在登革热病毒感染中，引起细胞死亡的主要方式是细胞凋亡，但是在该过程中也存在细胞焦亡。2013年，Wu等[34]在登革热病毒感染人原代巨噬细胞的试验中发现，caspase-1、IL-1β和IL-18的mRNA均上调表达，NLRP3在激活caspase-1中同样上调表达，表明巨噬细胞感染登革病毒后其自身可通过识别NLRP3，进而激活caspase-1，使细胞发生焦亡。2018年，研究人员发现，DENV-2在感染人巨噬细胞的过程中可激活caspase-4，同时caspase-4又可诱导caspase-1的活化IL-1β的分泌，表明在DENV-2感染过程中，细胞发生焦亡的机制不仅受caspase-1调控也可能受caspase-4调控[36]，但仍然需要进一步的研究和分析。总之，这些试验数据将有利于研究学者更加深入的了解和探究登革热病毒感染引发细胞焦亡所涉及的分子机制。

3.2.3腺病毒感染性疾病 腺病毒是一类具有多种血清型的无包膜双链DNA病毒，通常与急性上呼吸道，胃肠道和眼部感染等有关，腺病毒感染引发许多细胞因子的释放，包括IL-1、IL-6、TNF-α、IFN-γ；另外，腺病毒血清型5感染导致巨噬细胞炎性蛋白1α(MIP-1α)、MIP-1β和IL-8的释放[36]。2008年，Muruve等[37]研究表明腺病毒诱导巨噬细胞中IL-1β的成熟，其依赖于NALP3和ASC。随后，在2011年，Barlan等[38]研究证实腺病毒5型感染巨噬细胞后，通过其表面Toll样受体9(TLR9)识别腺病毒5型的双链DNA，进而诱导NLRP3、ASC及caspase-1的表达，且在感染期间，溶酶体膜受到破坏并释放溶酶体蛋白酶B进入细胞质中，产生ROS，进而激活 NLRP3，导致炎症介质IL-1β和 HMGB1的释放，Gasdermin D发挥作用，细胞膜完全性丧失，引发炎症反应，表明细胞焦亡相关因子参与腺病毒5型感染的发病机制。

3.3非传染性疾病

3.3.1动脉粥样硬化 动脉粥样硬化是一种慢性血管炎症性疾病，过量的葡萄糖、氧化性低密度脂蛋白、胆固醇晶及诸多炎症细胞因子如IL-1β、IL-18参与其形成过程。Nakashima等[39]的研究表明在动脉粥样硬化早期，主动脉血管内皮细胞中的caspase-1被激活，引起血管内皮细胞焦亡。2010年，Rajamäki 等[40]证实在巨噬细胞中，氧化型低密度脂蛋白和胆固醇晶体可以激活NLRP3炎性体，而后NLRP3激活caspase-1，使促炎因子IL-1β、IL-18成熟，继而介导巨噬细胞焦亡，促进动脉粥样硬化斑块的形成。2015年，Shi等[41]还观察到在患者的颈动脉粥样硬化斑块中NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β和IL-18上调表达。综上所述，依赖caspase-1介导的细胞焦亡参与动脉粥样硬化病变的发生发展，并且NLRP3炎性体及炎性caspase-1 等细胞焦亡相关的重要功能分子是促进动脉粥样硬化的形成重要因素。

3.3.2阿尔茨海默病 阿尔茨海默病是一种神经系统退行性疾病，其典型特征是广泛的神经细胞死亡和常见的老人痴呆。脑内过多或过少形成纤维肽β-淀粉样蛋白(Aβ)是导致痴呆和形成老年斑的主要原因。2006年，相关研究人员认为在阿尔茨海默病的过程IL-1β是纤维肽β-淀粉样蛋白(Aβ)诱导小神经胶质细胞炎症反应中的关键细胞因子[42,43]。在2008年，Halle等[44]研究发现，小神经胶质细胞中的NALP3炎性体能被Aβ激活，在此过程中，Aβ经由小神经胶质细胞内吞，随后溶酶体损伤，释放组织蛋白酶B到胞质中，从而使 NLRP3炎症小体活化，进而激活caspase-1，随后1L-1β得到释放，引发炎症反应。2014年，Tan等[45]经体外研究发现在阿尔茨海默病患者脑中，Aβ可使皮层原代神经元中的NLRP1上调表达，继而使NLRP1介导的caspase-1依赖性细胞焦亡发生。综上表明由Aβ激活NLR炎性体诱发的细胞焦亡可能是神经系统退行变化过程中的关键致病力，使用caspase-1抑制剂或阻断焦亡相关蛋白的表达可能阻止阿尔茨海默病的发病进程。

3.3.3痛风性关节炎 痛风性关节炎是一种由尿酸钠(MSU)晶体或焦磷酸二水合物(CPPD)晶体诱导的炎症性疾病，MSU和CPPD作为一种危险信号，可以被细胞表面和细胞质的模式识别受体识别，2006年，有文献报道表明，MSU和CPPD被NALP3炎性小体识别，继而激活NALP3，而后NALP3激活caspase-1，致使产生成熟的IL-1β和IL-18，进而诱发炎症反应[46]。2007年，Akahoshi等[47]已经证明了在痛风性关节炎的发病过程中，TLR4信号通路参与调控细胞焦亡，TLR4信号识别MSU并与骨髓分化首要反应蛋白(MyD88)相互作用，经过复杂的级联反应最终激活 NF-κB，从而调控炎症因子pro-IL-1β的表达，pro-IL-1β在NALP3 炎症小体激活途径中被切割形成成熟的IL-1β，诱发细胞焦亡。2014年，相关研究学者报道证实TLR4-NFκB-IL-1β信号传导可能在原发性痛风患者的急性炎症中起关键作用[48]。这些发现进一步证实炎性体在一些自身炎症性疾病中起到关键作用。

4 结语

细胞焦亡是一种不同于细胞凋亡的独特程序性细胞死亡方式，近年来，随着对细胞焦亡的深入研究，改变了起初我们对细胞焦亡和程序性坏死的认识，它涉及 caspase-1、11的激活和caspase-1、11对Gasdermin D的切割，以及炎症细胞因子 IL-1β 和 IL-18 的成熟和释放，均可引发细胞焦亡。迄今为止，虽然对细胞焦亡进行了一些研究，但是这一类型细胞死亡的生理、生化基础等诸多不清楚的地方还有待于更进一步的研究。细胞焦亡可以参与到多种疾病进程当中，通过深入研究细胞焦亡发生的分子机制，可能有助于我们进一步了解细胞程序性死亡的多样性。除此之外，我们可能通过对细胞焦亡的调控机制和检测技术的深入研究，来找到治疗相关疾病的靶点。因此，随着对这些问题的深入研究，可以对临床防治病原体的感染、自身免疫性疾病的治疗和诊断以及新药设计和开发等提供新的思路。