造影剂肾病动物模型研究进展

张志明，林开阳，林茂强，徐家豪，严晗，陈汉川，王孙蓥，陈希男，刘东辉，郭延松

(福建医科大学省立临床医学院，福州 350000)

随着现代影像放射检查技术和介入手段的广泛发展，造影剂的应用日益增多，发生造影剂肾病(contrast-induced nephropathy，CIN)也随之增多。CIN是急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)的主要原因之一，CIN患者不仅预后差，而且并发症发生率高，总住院时延长。目前CIN的发病机制仍然不清楚，缺乏有效的预防手段，因此对CIN发病机制的研究是目前研究的热点。动物模型的构建是研究CIN发病机制的基础，但动物模型制备缺乏公认的方法。本文对CIN进行简单概述，并对CIN动物模型研究进展做一综述。

1 CIN概述

CIN被定义为造影剂接触后48 ～ 72 h 血肌酐绝对值较基础值升高≥0.5 mg/dL(44.22 μmol /L)或相对升高≥25%, 并排除其他可能引起肾损害的原因[1]。它是医院获得性急性肾损伤第三大主要原因，占据了所有医院获得性肾损伤的11%[2]。CIN的发病机制目前尚不完全明确，可能与血流动力学的改变、直接的肾小管细胞的损伤、活性氧的产生有关[3]。已经证实了造影剂增加了渗透负荷，减少了肾血流量，诱导了肾动脉收缩。这种条件促进了活性氧的产生，造成了缺血性肾小管损伤，这可以被认为是直接肾小管毒性的原因[4]。

CIN的危险因素包括了慢性肾病、糖尿病、低血压、造影剂的体积、充血性心力衰竭、高龄和贫血[5-8]。CIN目前尚缺乏有效的治疗手段，加强对CIN病因和发病机制的研究，开发出更有效的防治措施是极其重要的。而CIN动物模型能较好地复制疾病状态，是进行相关研究的第一步。现从实验动物、CIN动物模型的具体构建方法(预处理和造影剂的使用)等方面阐述CIN动物模型的构建。

2 CIN动物模型的构建

2.1 实验动物

CIN动物模型常用大鼠(大多数为8 ～ 10周龄，200 ～ 220 g，雄性Sprague-Dawley大鼠)，大鼠同源性较好，应用较多。其他少见动物有狗、家兔、猪。临床中CIN的患者大多伴随有心血管疾病、糖尿病和慢性肾病，因此个别模型所选用的是一些患有高血压、糖尿病、慢性肾病的动物[9]。

2.2 CIN动物模型具体构建方法

CIN在具有危险因素患者身上更加普遍和严重[10]。另外，多数实验动物特别是正常大鼠能够耐受高剂量的造影剂而对肾功能不会产生明显的影响[11]，即使用多种高剂量的造影剂后，动物对造影剂肾毒性的敏感性仍然很低[12]。因此，大多数CIN模型制备主要分为两个步骤：先对动物进行预处理形成一种潜在的肾病理改变，然后再使用造影剂进行造模。动物预处理的方式多样，包括：肾小管毒性药物使用、肾血管收缩药物使用、脱水处理、进行部分肾切除、糖尿病大鼠诱导、肾血管结扎等。

2.2.1 肾毒性药物预处理诱导CIN动物模型

在临床上，庆大霉素极易引起肾小管受损，严重者可导致AKI。 19世纪70年代，就已经报道在使用庆大霉素治疗的患者中发生AKI[13]。大剂量庆大霉素进入血液后，绝大部分呈游离状态，在体内不进行生物转化，大部分以原型从肾小球滤出，只有小部分在近端小管重吸收，因此肾小管中庆大霉素浓度比血浆高数十倍。在使用庆大霉素治疗的患者中，主要的不良反应包括肾小管坏死和肾小球滤过率(GFR)下降[14-15]。19世纪90年代，也有过使用庆大霉素每天预处理进行CIN动物模型制作的报道[16-17]。目前使用庆大霉素每天预处理的注射剂量有50 mg/(kg·bw)[18]、60 mg/(kg·bw)和70 mg/(kg·bw)[19]。

甘油为高渗性物质，甘油肌注导致的实验动物性急性肾小管损伤(ATN)的表现与临床上某些ATN相似，它同时具备了肾缺血和肾毒性作用[20]。小鼠经过甘油预处理后血清尿素氮和肌酐明显上升，光镜观察可以看到肾小管上皮细胞坏死脱落，管腔中存在大量管型。目前使用甘油预处理的浓度为25%，注射剂量为10 mL/(kg·bw)[21-23]。

上述这些药物的肾小管毒性突出，往往出现广泛的肾小管上皮变性，与CIN所致肾小管毒性难以鉴别，目前较少使用。

2.2.2 肾血管收缩预处理诱导CIN动物模型

(1)肾血管收缩药物预处理诱导CIN动物模型

造影剂、吲哚美辛、N-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME，一氧化氮合成酶抑制剂),单独使用几乎不能造成肾功能不全，只能造成微小的形态学损伤。无论是在造影剂之前使用吲哚美辛或L-NAME，还是不使用造影剂只联合使用吲哚美辛和L-NAME都不能对肾髓袢升支粗段造成持续性损伤。联合使用吲哚美辛或L-NAME预处理后才能形成显著的肾衰竭，肌酐清除率下降25%，将近一半的髓袢升支粗段坏死[24]。

一氧化氮(nitric oxide，NO)和前列腺素是内皮源性血管舒张因子，生理状态下持续释放来维持血管的扩张状态，肾内这些扩血管物质的产生对保持肾灌注及供氧较差的髓质的血流灌注和供氧是重要的，NO和前列腺素在肾对造影剂的反应中有重要的保护作用。在肾疾病状态下这些血管活性物质的合成减少将使患者更加容易发展成为造影剂肾病[24]。

造影剂与前列腺素合成酶抑制剂(吲哚美辛)联合使用时，可显著降低肾小球滤过率，然而吲哚美辛本身并不能降低肾功能[25]。运用吲哚美辛可抑制前列腺素的合成，可能使肾倾向于发生急性肾衰竭(acute renal failure，ARF)[26]和髓质缺氧损伤[25]，它被试图作为一种放大造影剂的肾损伤的方式。吲哚美辛在磷酸盐缓冲液(pH 8.0)中溶解，注射剂量为(10 mg/kg)。之所以选择这种剂量，是因为人们发现它能有效抑制前列腺素合成，而且对正常大鼠肾功能损伤最小[27]。L-NAME(N-硝基-L- 精氨酸甲酯)能抑制NO的合成，动物模型中L-NAME的注射剂量也为10 mg/(kg·bw)。目前肾血管收缩药物诱导CIN动物模型的建模方式为吲哚美辛注射15，20或者30 min后注射L-NAME[28-31]。

这一预处理的优点是操作迅速，避免了其他预处理的慢长预备和手术步骤，而且目前CIN主流的机制是：肾血管收缩，肾髓质缺氧。但是肾血管收缩药物的间隔给药时间目前尚未统一，而且这是一种AKI前提下诱导CIN模型，并不能模拟CIN患者慢性肾功能不全、糖尿病、脱水等实际情况，实验结论缺乏说服力。

(2)脱水预处理诱导CIN动物模型

慢性失水已经被证实是造影剂肾病的危险因素[27]。Larson等[32]在脱水的狗身上证实了肾素血管紧张素系统的地位。在已经存在的肾素血管紧张素系统中，研究者证实了脱水能够放大造影剂引起的血管收缩和舒张反应[33]。脱水增加肾血管对造影剂的敏感性，这个原理被用作了CIN动物模型的制备[34]。脱水的处理方式主要为动物禁水和肌肉注射呋塞米10 mg/(kg·bw)。动物禁水的时间大部分为24 h，少部分为48 h和72 h。但是单纯的动物脱水几乎不会影响大鼠的血容量，甚至脱水会让动物减少食物的获取，进而降低肌酐和尿素氮水平[35]。

脱水预处理能够激活肾素血管紧张素系统，导致肾血管收缩，模拟CIN发病机制肾髓质缺氧。然而单纯使用脱水进行预处理的模型可能只引起轻微的肾损伤[36]，因此脱水预处理常与其他预处理方式相结合。

肾血管收缩预处理与CIN发病机制相贴近，但成功率尚不明确，我们课题组曾采用该预处理方式建立CIN模型，但成功率低，为提高成功率，近年来文献报道采用肾部分切除预处理诱导CIN模型。

2.2.3 肾部分切除预处理诱导CIN动物模型

慢性肾功能不全本身就是引起造影剂肾病的一种危险因素[37]。大鼠部分肾被切除之后，残余肾单位将出现高灌注和高滤过状态，这是导致肾小球硬化和残余肾单位进一步丧失的主要原因。长期的肾单位的减少会增加大鼠对造影剂损伤的易感性[38]。刘晓城等[39]曾报道过此类慢性肾功能不全动物模型的制备方法，主要分为两个步骤：先进行右侧肾的完全切除，1周后行左侧肾上下侧切除，保留其中间的1/3，第8周时慢性肾功能不全的动物模型建立成功。然而对于CIN动物模型，常选择在肾切除5/6后的第6周给予注射造影剂，因为此时的肾功能最稳定[40-42]。

该预处理模拟了CIN患者慢性肾功能不全的危险因素，而且预处理效果可靠。缺点在于手术过程肾损伤较大，同时需要熟练操作才能降低动物死亡率。

2.2.4 糖尿病预处理诱导CIN动物模型

糖尿病肾病是造影剂肾病的重要危险因素之一。一项1196例患者(包括216例糖尿病肾病患者)的多中心随机对照研究表明,在糖尿病肾病合并肾功能不全患者中,当血清肌酐大于或等于4.5 mg/dL时, 造影剂对肾功能损伤的发生率达100%[43]。糖尿病大鼠8周后，肾皮质组织MDA(丙二醇)水平与对照组相比显著升高，在此基础上给予造影剂，肾皮质组织MDA水平又更进一步升高，且差异有显著性，提示糖尿病肾病本身就可以产生多种肾损伤因子，给予造影剂后肾损伤加重[44]。Cordaro等[45]将链脲佐菌素(STZ)溶解在pH 4.5的柠檬酸钠缓冲液，以60 mg/(kg·bw)的尾静脉注射进行预处理，24 h后，血糖水平大于250 mg/dL的动物被认为是糖尿病，10 d后注射造影剂建立CIN模型。然而大部分糖尿病预处理诱导CIN模型都是在糖尿病形成8周后，注射造影剂[44]。

糖尿病预处理模型能很好的模拟CIN患者糖尿病背景，缺陷在于慢性病预备周期较长。

2.2.5 其他预处理诱导CIN模型

将大鼠进行高胆固醇膳食及单侧结扎肾动脉、输尿管等建立CIN动物模型，但是这些预处理的方式运用的极少。为了进一步提高造模的成功率，以上的预处理方式常常多种相结合，如：将肾血管收缩预处理与肾部分切除预处理相结合，将肾血管收缩处理与糖尿病预处理相结合。

2.2.6 造影剂的应用

制备CIN动物模型最核心的步骤是造影剂的应用。目前常用造影剂的类型和剂量分别为：高渗离子型造影剂：泛影葡胺[3000 mgI/(kg·bw)]；低渗非离子型造影剂：碘海醇[3500 mgI/(kg·bw)]、碘帕醇[2900 mgI/(kg·bw)]、碘普罗胺[1600 mgI/(kg·bw)]、碘佛醇[3000 mgI/(kg·bw)]；等渗非离子型造影剂：碘克沙醇[3200 mgI/(kg·bw)]。

大部分造影剂的给药途径为尾静脉，少部分使用的颈内动脉和腹腔。腹腔给药方式最简单，然而与临床给药途径相悖，运用最少。颈内动脉造影剂给药难度最大，与临床造影剂动脉给药途径相似，周英林等人将大鼠脱水16 h后，用碘帕醇以2900 mgI/kg的剂量通过左颈内动脉注射的方式成功建模。CIN模型前期主要应用的高渗离子型造影剂，近年来低渗非离子型造影剂和等渗非离子型造影剂应用比例逐渐增加，这与临床的应用趋势相适应。

3 CIN动物模型造模成功的依据

CIN动物模型常常留取基线血和造模后的血肌酐的水平进行对比，在接触造影剂48 ～ 72 h 血肌酐绝对值较基础值升高≥0.5 mg/dL (44.22 μmol /L) 或相对升高≥25%，称之为CIN动物模型造模成功。然而用肌酐判断CIN动物模型造模成功存在一定的缺陷，大鼠在进入脱水状态下常常会自主减少食物的摄取[45]，这就极易影响肌酐的水平，而且肌酐数值存在一定的滞后性，需在肾小球滤过率下降达到50%以上时，肌酐才会有所上升，此时肾已存在严重的病理改变，因此CIN动物模型造模成功可能更多的需要依赖于肾的病理改变来判断。

4 小结

CIN的发病机制是肾血管收缩，肾髓质缺氧等。目前尚缺乏统一CIN模型的预处理方式。大多数CIN动物模型的预处理是为了模拟临床上CIN患者脱水、肾功能不全、糖尿病、高脂血症等危险因素，其目的为了使肾形成一种易形成CIN动物模型的状态。由于人类疾病的复杂性及特异性，动物模型并不能模拟人类CIN的所有特质。CIN动物模型在研究CIN发病机制及并发症方面起着关键的作用，相信随着相关研究的不断深入，将进一步揭示CIN发生、发展的规律，并为CIN的治疗提供帮助。