魏氏梭菌外毒素引起细胞死亡的作用机制

许崇利,许崇波

（1.重庆医药高等专科学校医学技术学院，重庆401331；2.韶关学院英东生命科学学院，广东韶关512005）

魏氏梭菌是普遍存在于土壤、腐败有机物和许多动物肠道中的一种革兰氏阳性厌氧菌，其产生的高抵抗力内生孢子使其能在土壤等环境中持久存在[1－3]。魏氏梭菌产生大量毒素使其成为人类和动物非常严重的病原体，导致组织毒性、肠炎和肠毒血症等疾病[4－5]。根据产生的毒素类型分为A、B、C、D和E型，最近F和 G型被归为新的菌型，F型产生肠毒素，但其不产生β毒素、ε毒素、ι毒素而G型主要产生坏死性肠炎毒素B[6－7]。魏氏梭菌毒素蛋白通过识别靶细胞膜上相应受体从而激活细胞内信号途径导致细胞病变最终引起细胞死亡[8－9]。近年对病原体诱导的宿主细胞死亡的研究揭示出这种过程涉及到各种复杂机制，而以前则认为其只是简单的偶然过程。除了坏死和细胞凋亡两种经典的细胞死亡途径外，目前广为所知的是许多病原体也可以触发相应的途径导致细胞死亡，包括细胞程序性坏死、自噬、细胞焦亡和细胞凋亡等途径。掌握病原体杀死宿主细胞的作用机制和相关因子对于破译细菌发病机制至关重要，是探索新型治疗方法的关键途径。

1 α毒素

1.1 α毒素遗传学特性和结构特征 所有魏氏梭菌型均产生α毒素，其由370个氨基酸组成的锌离子多功能金属酶，在有钙离子存在的情况下结合到宿主细胞的细胞膜上。α毒素包括N端催化结构域和C端结合结构域，另外还包括一个含有神经节苷脂结合位点的中心环结构域[8]。α毒素具有致死性，溶血性和皮肤坏死性，是人类气性坏疽最重要的毒力因子，其主要特征表现为骨骼肌坏死，皮下水肿和肺气肿，休克，多器官衰竭和死亡，此外在气性坏疽中观察到胆固醇依赖性溶细胞素的家族成员产气荚膜梭菌溶素O与α毒素协同作用从而导致病理效应[10]。然而产气荚膜梭菌溶素O在疾病中的所起的作用似乎很小，虽然A型魏氏梭菌与动物气性坏疽有关，但α毒素作用机制尚未完全阐释清楚。α毒素的活性非常复杂，因质膜中磷脂酰胆碱（PC）与鞘磷脂（SM）的比例等诸多因素的影响而产生变化，而且还受到局部毒素浓度的影响。因此许多α毒素作用途径受这些因素影响。α毒素水解细胞膜中的磷脂酰胆碱与鞘磷脂产生二酰甘油和神经酰胺。除了这些活性，α毒素还可通过与Gi型GTP结合蛋白的相互作用间接激活与磷脂酶和鞘磷脂酶类似的内源性宿主酶[11]。然而α毒素的作用不仅局限于裂解细胞膜，其含有神经节苷脂结合位点的中心环结构域还可促进细胞膜上的原肌球蛋白受体激酶A的相互作用和联结，从而激活MEK/ERK途径[12]。有趣的是，缺乏神经节苷脂的DonQ或GM95细胞对α毒素作用高度敏感。神经节苷脂是糖鞘脂，可降低细胞膜的流动性，导致磷脂更紧密堆积在一起，并且还与影响底物利用率的静电变化有关。这些作用可能会干扰α毒素的膜破坏活性，从而保护细胞免受细胞损伤。唾液酸对于神经节苷脂的结构非常重要，如果用唾液酸酶除去唾液酸则可增加细胞对α毒素的敏感性，这意味着α毒素和唾液酸酶之间存在潜在的协同作用。唾液酸酶的这种协同作用也可以增加其他魏氏梭菌毒素如 β毒素、ε毒素和肠毒素的结合活性。

如前所述，α毒素与细胞膜结合并作用于磷脂酰胆碱与鞘磷脂，除了激活Gi－GTP－BP信号途径，还根据细胞类型触发不同的信号途径。如马红细胞由于α毒素的磷脂酶水解膜上的磷脂酰胆碱而裂解，也可能是由于内源性的磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C活化而裂解，而α毒素对于含有微量磷脂酰胆碱的绵羊红细胞的影响主要通过激活GTPBPs途径的鞘磷脂代谢。在兔中性白细胞和DonQ细胞中，α毒素诱导的超氧阴离子的产生主要通过内源性磷脂酶C的活化和经由TrkA受体的PI3K磷酸化，以及 PDK1、PKCθ、MEK1/2、ERK1/2 系统和NF－κB的磷酸化[13]。除了激活稳定 IL－8 mRNA的p38MAPK途径外，该途径对A549细胞产生IL－8也很重要。另外气性坏疽感染组织中的中性粒细胞缺乏及其在血管内皮上的积累可能是由于升高的IL－8促使中性粒细胞紧密粘附于细胞外基质蛋白而产生的影响。最近的研究还报道了由α毒素诱导的外周血中性粒细胞的分化和补充受损主要归因于这些细胞中含有GM1a的脂筏的改变。此外，气性坏疽期间厌氧微环境的持续性被认为是α毒素诱导的花生四烯酸代谢活化的结果，该过程由与炎症、肌肉收缩、血小板聚集和血管收缩密切相关的磷脂酶A2、产生前列腺素、血栓和白细胞三烯来完成，从而最终导致灌注减少[14]。

1.2 α毒素引起细胞死亡的作用机制 α毒素溶解浓聚物可导致细胞膜的降解和乳酸脱氢酶大量释放，这是坏死的典型特征。亚溶解浓聚物的α毒素能激活MEK/ERK信号途径并产生活性氧（ROS），一定数量的活性氧可导致细胞氧化应激并启动内在的细胞凋亡。最近的一项研究表明在GM95细胞中，低剂量α毒素诱导的鞘磷脂代谢与促凋亡介质如神经酰胺、N－乙酰乙醇胺和饱和脂肪酸的产生，以及线粒体细胞色素 C的释放，细胞凋亡蛋白酶3的激活以及磷脂酰丝氨酸的增加有关。之前的研究表明神经酰胺在细胞凋亡中充当第二信使的作用，神经酰胺被加工成鞘氨醇，其在胞内的蓄积可导致溶酶体破裂最终释放出大量的参与细胞凋亡的溶酶体酶。当α毒素被含胆固醇的细胞质膜微囊吞噬时形成胞内体并激活相应的信号通路，产生的活性氧导致溶酶体的损伤。另外胞浆内高水平的Ca2＋在细胞凋亡和坏死中扮演着关键的角色。α毒素促使1－磷酸－鞘氨醇和三磷酸肌醇的形成，二者都与胞浆内Ca2＋的运输和蓄积有关[15]。然而到目前为止，胞浆内Ca2＋作为与α毒素相关的特定细胞死亡途径的触发器角色仍然没有被详细研究。

2 β毒素

2.1 β毒素遗传学特性和结构特征 大毒力质粒携带β毒素基因cpb，该质粒也含有其他的毒素基因cpe和tpeL。β毒素是由336个氨基酸组成的强毒素，期中27个氨基酸的信号序列在分泌后被去除从而形成35 kD的成熟肽。推测的β毒素氨基酸序列与与金黄色葡萄球菌的δ毒素和β穿孔毒素具有显着的同源性。β毒素被归分类为α－溶血素家族中的梭状芽孢杆菌β穿孔毒素，其对胰蛋白酶和其他蛋白酶极为敏感。由于对胰蛋白酶的敏感性，在体内外β毒素只在胰蛋白酶抑制剂存在时才有活性。变种的β毒素可能拥有不同的胰蛋白酶敏感性和体外细胞毒性。β毒素由B型和C型魏氏梭菌产生并且是人和动物几种疾病主要的致病因素。B型魏氏梭菌产生的β毒素可引起绵羊致命性出血性痢疾，而C型魏氏梭菌分泌的β毒素则可引起几种动物的坏死性肠炎和肠毒血症及人类的坏死性肠炎。使用等基因无效突变体技术研究表明，β毒素可以重现兔小肠环中C型魏氏梭菌的病理学特征，同时也是山羊C型魏氏梭菌疾病的主要的毒力因子[16]。另外β毒素也是鼠肠毒血症模型中主要的致死因素[17]。

与β毒素相关疾病的病理学特征主要表现为小肠和大肠上皮细胞出血和坏死。β毒素引起的损伤始于肠粘膜但可发展到肠的所有层。阻塞粘膜固有层中存在的超级微血管的纤维蛋白血栓是与β毒素相关的肠道疾病的主要特征。粘膜上皮是毒素诱导损伤的主要目标还是继发于血管血栓形成一直是争论焦点。在兔肠环模型中，接种野生型魏氏梭菌C型分离株CN3685在血栓形成明显之前产生绒毛尖端坏死，意味着早期肠上皮细胞损伤。另一方面，在仔猪和人类患者的坏死性肠炎病例以及早期血管病变的猪感染模型中的粘膜固有层上皮细胞中均通过免疫组织化学技术证实β毒素的作用。然而，在所有这些研究中，已经出现的组织坏死并未检测到β毒素与上皮细胞的结合，对猪空肠外植体β毒素免疫组织化学的进一步研究表明毒素与上皮细胞并没有结合，而且完整上皮细胞层的存在抑制肠内层β毒素的测定[18]。同样的研究显示，与重组β毒素共培养时，猪肠上皮细胞和原代空肠上皮细胞均没有出现细胞病变效应。在猪肠道模型中曾提出上皮细胞的最初损伤是源于β毒素到达粘膜固有层的微血管。但是，因为抗β毒素抗体并没有阻止两株C型魏氏梭菌菌株上清诱导的猪肠上皮细胞的损伤，从而可以推断β毒素并不是细胞病变效应的主要因素[18]。此外，观察到β毒素在小鼠皮肤中的间接血管作用，毒素能够诱导物质P（一种来自感觉神经元的NK1激动剂）的释放，最终导致TNF－α和血浆外渗物的释放[19]。

作为寡聚体的穿孔毒素β毒素可在易感细胞的细胞膜上形成功能性孔道。通过这些孔道K＋流出胞外，Ca2＋、Na＋和 Cl－流入胞内，同时细胞发生膨胀。β毒素诱导的钾离子流出促进p38 MAP和JNK激酶的磷酸化，从而激活与宿主细胞存活和适应相关的途径。已经在不同的人造血肿瘤细胞系中测试了细胞对β毒素作用的易感性，与HL－60、BALL－1和MOLT－4相比，THP－1和U937细胞显示出最高的β毒素诱导的细胞毒性。使用原代猪主动脉内皮细胞，结果证明β毒素可诱导肌动蛋白细胞骨架的快速裂解、细胞边缘回缩和细胞皱缩。细胞易感性的差异清楚地表明毒素与特异性受体结合。最近研究表明β毒素可能与ATP门控的P2X7受体结合，之后ATP通过称为Pannexin 1的ATP通道从细胞中释放出来。与β毒素结合相关的ATP释放的方式尚不清楚；然而，它与细胞裂解无关。也许，通过β毒素CPB孔道的Ca2＋的初始流入能诱导线粒体ATP产生并且随后从受影响的细胞中释放出去。据推测，通过Panx1通道ATP从细胞释放并迅速达到峰值可刺激β毒素寡聚体的进一步形成，从而导致细胞毒性。Panx1与结合β毒素的P2X7受体相互作用将影响Panx1通道开放并促进ATP释放[20]。肠细胞和内皮细胞均表达P2X7受体和Panx1，但它们在体内与β毒素有关疾病中的作用需要进一步研究。

2.2 β毒素引起细胞死亡的作用机制 使用猪内皮细胞的研究表明，重组β毒素能迅速诱导与坏死一致的特征，包括LDH释放和碘化丙啶的摄入。二者都可被钙蛋白酶抑制剂和necrostatin－1（受体相互作用蛋白激酶1抑制剂）所抑制，这表明β毒素诱导的坏死性细胞死亡不是被动事件，而是通过程序化的生化途径完成的。研究人员推断necrostatin效应表明β毒素诱导细胞程序性坏死。然而值得一提的是necrostain的作用靶标受体相互作用蛋白激酶1也可能参与细胞凋亡过程[21]。另一方面，研究同时检测到低水平的细胞凋亡蛋白酶－3活化，但没有明显的DNA片段化，这表明在毒素浓度和孵育时间的条件下，细胞凋亡不是重要的细胞死亡途径。细胞凋亡蛋白酶－3在这些细胞中是怎样被活化的并没有进一步研究，也许可以假设胞浆中钙离子上升可能起到关键作用，因为其通过活化钙激酶从而与细胞凋亡和细胞程序性坏死密切相关[22]。

3 ε毒素

3.1 ε毒素遗传学特性和结构特征 ε毒素基因etx与其他毒素基因cpb2和cpe都位于质粒上，ε毒素先以无活性的前体形式分泌，分子量约为33 kD，随后被宿主产生的肠蛋白酶所激活，这些酶主要有胰蛋白酶、α－糜蛋白酶、羧肽酶类和λ－蛋白酶。利用胰蛋白酶、α－糜蛋白酶去除ε毒素前体N末端13个氨基酸残基和C末端29个氨基酸残基使其成为成熟的ε毒素，毒性是其前体的1000倍。魏氏梭菌λ－蛋白酶仅去除N－末端10个氨基酸残基。在使用山羊肠内容物的离体研究中，ε毒素前体通过SDS－PAGE逐步形成约为27 kD的稳定条带。该条带含有三种不同C末端的ε毒素且每种都具有细胞毒性。这种ε毒素C末端序列的加工显然是由肠羧肽酶来完成的。上述研究表明当仅使用纯化的蛋白酶时，体内ε毒素活化比先前报道的更为复杂[23]。鉴于其与气单胞菌产生的气溶素结构相似性，ε毒素被归类为气溶素家族的七聚体β穿孔素，尽管它们之间没有显著的氨基酸序列相似性。ε毒素是继肉毒菌毒素和破伤风毒素后已知的第三种最有效的梭菌毒素，由B型和D型魏氏梭菌合成。通过etx基因敲除的绵羊、山羊和小鼠模型研究证实ε毒素是D型魏氏梭菌引起的肠毒血症的主要致病因子[24]。

ε毒素在肠道中产生，即使在羊肠毒血症中可能存在纤维坏死性结肠炎情况下，其作用靶标主要是中枢神经系统、肺和心脏等器官。ε毒素通过增加肠通透性来促进其自身的吸收。这种效果尚未完全清楚，但它涉及粘膜紧密连接的断裂和肠道固有层的退行性变化。在显微镜下，脑部病变往往是多灶性的，其特征是血管周围和壁内血管水肿、出血，并且在多数慢性病例情况下，白质坏死和星形胶质细胞和轴突肿胀。后者通常是对称的和双边的。这些病变的起源被认为是毒素与脑－血屏障的内皮细胞的初始结合的结果，因为在小鼠中静脉内接种用绿色荧光蛋白标记的ε毒素显示出毒素结合到这些细胞上[25]。与ε毒素结合后，内皮细胞变得肿胀，空泡化和坏死。通过破坏脑－血屏障，发生液体和蛋白质的渗漏，导致水肿，引起神经薄壁组织的机械损伤和缺氧。为了应对这种水肿，大鼠和绵羊的星形胶质细胞过表达水通道蛋白－4，这也许是宿主试图从血管周围空间减少多余的液体。除了对大脑的这种间接影响外，ε毒素还可直接影响某些神经元和少突胶质细胞，但不影响星形胶质细胞[26]。注射绿色荧光蛋白标记的ε毒素显示出肾脏发生严重改变，包括远端小管变性和髓质出血。使用来自不同物种的肾源的细胞系已经广泛研究了ε毒素的结合特性和细胞毒活性，其中尚未报道狗、小鼠和人的D型肠毒血症病例。ε毒素作用的起始步骤涉及与未知细胞表面受体结合并在膜表面形成一个七聚体的前孔，随后插入到细胞膜以形成活性孔。最近的研究表明ε毒素激活中性鞘磷脂酶，其反过来通过在质膜中产生神经酰胺来促进寡聚体的形成。事实上，敲除中性鞘磷脂酶阻断了ACHN细胞中的寡聚体形成和ε毒素诱导的细胞死亡。由于从魏氏梭菌培养物中分离的ε毒素可能含有α毒素杂质（其也可诱导神经酰胺的形成），由于α毒素也能产生这样的效应，从而表明两种毒素可以协同发挥作用，当然这种可能性尚未进行深入研究[27]。在体外，ε毒素与MDCK和ACHN细胞中的甲型肝炎病毒细胞受体相结合促进细胞毒性。然而，在对ε毒素具有抗性的细胞中诱导甲型肝炎病毒细胞受体表达并不会导致其对毒素的敏感性。已发现几种细胞类型中的髓鞘质和淋巴细胞蛋白是ε毒素细胞毒性所必需的。髓鞘质和淋巴细胞蛋白是内皮细胞，肾细胞和少突神经胶质细胞等许多细胞的ε毒素靶标。髓鞘质和淋巴细胞蛋白也许是ε毒素特异性受体，其组装成多蛋白复合体用于ε毒素与细胞膜相互作用，甚至本身具有一套独立于孔形成的机制[28]。

3.2 ε毒素引起细胞死亡的作用机制 与ε毒素作用相关的细胞内途径和细胞死亡的机制尚未完全被阐释清楚。然而毒素诱导的细胞内变化与坏死特征相一致，如显著的细胞肿胀、线粒体消失、起泡、膜破裂、ATP消耗、核皱缩、碘化丙啶摄取增加及无DNA片段化。受感染细胞形成孔导致胞内K＋的快速流失，Cl－和Na＋的流入，随后是胞浆内Ca2＋的增加。这种细胞内电解质的不平衡尽管看起来很有可能参与激活特定的下游信号事件最终导致细胞死亡，但是迄今为止并没有得到证实。受ε毒素影响的细胞失去了产生能量所需至关重要辅酶，特别是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和辅酶A，有助于线粒体膜电位的消散和线粒体通透性转换孔的开放。与上述结果一致，AMP激活的蛋白激酶（ATP胞内感受器），在受ε毒素影响的细胞中受到影响。此外，凋亡诱导因子（一种有效的半胱天冬酶非依赖性细胞死亡因子）从线粒体转移到细胞核。在体外用ε毒素处理的肾细胞中，大分子的细胞旁通透性没有显着增加，并且肌动蛋白细胞骨架和粘着连接的组织不受影响。在大脑中，ε毒素可与某些类型的神经元结合并导致膜电阻降低，这归因于孔形成。这诱导了与胞浆中Ca2＋增加相关的膜去极化，随后释放出神经递质谷氨酸。有趣的是，ε毒素不会在少突神经胶质细胞膜中形成孔道；因此，相关的谷氨酸释放，通过不同机制发生的Ca2＋波动和脱髓鞘，如ε毒素和髓鞘质和淋巴细胞蛋白相互作用的胞内途径。

4 ι毒素

4.1 ι毒素遗传学特性和结构特征 ι毒素是由酶组分（Ia）和结合组分（Ib）组成的二元毒素。两种成分均由两个独立的基因iap和iab编码，两个基因位于大的接合质粒上。Ib分子量为100 kD，合成初期无活性，胰蛋白酶或糜蛋白酶水解除去20 kD N－末端片段后变成有活性的蛋白体。ι毒素由E型魏氏梭菌菌株分泌。许多动物的肠道疾病均与该毒素有关。然而，大多数病例的诊断仅基于从出血性肠炎动物的肠内容物中分离出的E型魏氏梭菌，但是这并不是E型魏氏梭菌感染的诊断标准。此外科赫原则尚未完全应用于E型疾病，ι毒素在疾病中的具体作用仍不清楚。在过去，基于在被感染动物的肠中检测到ι毒素，将兔肠毒血症的归因于E型魏氏梭菌的感染。然而，据推测，这些病例可能是由梭状芽孢杆菌产生的类似ι的毒素引起的，通过目前可用的毒素检测方法证实其与ι毒素交叉反应。到目前为止，还没有可靠的诊断标准用于诊断与E型魏氏梭菌相关的肠道疾病已报道脂解激活脂蛋白受体（LSR）是Ib的细胞受体，其介导毒素进入宿主细胞。研究表明ι毒素进入宿主细胞涉及细胞表面抗原CD44相关的内吞作用[29]。一旦与受体结合，Ib组装成七聚体并插入宿主细胞膜形成功能性通道，从而允许离子运输以及Ia的易位和内吞作用。Ia酶组分也以无活性的形式分泌，需要蛋白水解除去N末端9至11个残基才能成为成熟蛋白体。Ia的C－结构域负责毒素的ADP－核糖基化活性，其涉及肌动蛋白177位精氨酸残基与ADP－核糖基化的供价连接，这导致肌动蛋白丝的解聚和G－肌动蛋白单体的增加。肌动蛋白细胞骨架的解聚导致细胞形态的变化和细胞间紧密和基底外侧连接的解体，导致培养的肠细胞渗透性增加。两种ι毒素组分都通过依赖ρ因子，网格蛋白非依赖性途径内化于靶细胞中并到达内吞囊泡。一小部分Ib再循环回到细胞膜，使Ia的摄取进一步增强。内吞后Ia从晚期内体转移到细胞质中，在那里发挥ADP－核糖基化活性，这种易位需要晚期内体具有酸性环境[30]。

4.2 ι毒素引起细胞死亡的作用机制 已有的研究证实Ib本身可以诱导细胞毒活性，特别是在两种人细胞系A431（上皮癌）和 A549（肺腺癌）。这些细胞毒性作用涉及显著的细胞肿胀，线粒体功能障碍，ATP消耗和IP摄入增加，所有特征均与坏死相一致。即使观察到促凋亡分子Bax和Bak的活化以及细胞色素C释放，但未检测到细胞凋亡蛋白酶－3的活化，并且用泛半胱天冬酶抑制剂Z－VAD－FMK孵育细胞并不能保护细胞免受Ib诱导的细胞死亡。在该研究中，细胞存活需Ib的内吞，表明内吞作用在保护细胞免受与Ib相关的孔形成中扮演关键角色。而在另一项研究中，ι毒素处理Vero细胞在孵育12～15 h后诱导细胞凋亡蛋白酶－3活化。这种凋亡细胞死亡的延迟诱导归因于ADP－核糖基化Ia靶向肌动蛋白的细胞溶质稳定性[31]。

5 肠毒素

5.1 肠毒素遗传学特性和结构特征 cpe基因既可以位于染色体上也可以位于质粒上，并且毒素仅在孢子形成期间表达。肠毒素由319个氨基酸组成的单链多肽。肠毒素的C末端没有细胞毒活性，但介导与受体的结合，其末端位于30个氨基酸中的酪氨酸残基起着关键作用。另一方面肠毒素的N末端具有细胞毒性且对于肠毒素的寡聚化和膜孔的形成尤为重要。肠毒素是F型魏氏梭菌孢子形成时期产生的成孔毒素，但C型和D型魏氏梭菌也产生肠毒素，另外E型魏氏梭菌携带有沉默的cpe基因或产生肠毒素变种。实验和流行病学证据表明肠毒素是与人类食物中毒相关的F型魏氏梭菌的主要毒力因子。在兔子中产生肠毒素的F型魏氏梭菌验证了科赫原则且5%～10%抗生素相关性腹泻与F型魏氏梭菌有关[32]。肠毒素引起的食物中毒主要症状包括腹泻和腹部痉挛，并且通常在一两天后自发消退。然而在便秘或粪便嵌塞等一些因素诱发下则成为致命性的。在上述条件下减少腹泻影响，毒素会延长其与肠的接触，促进吸收以及与肠外器官的作用。这种肠毒性作用在结扎小鼠的肠环中得到验证，接种的肠毒素进入循环并引起高血钾导致死亡。肠毒素的细胞受体属于紧密连接蛋白家族（claudins）成员，位于上皮细胞和内皮细胞之间的顶端接触区域。已经证实claudins 3、4、6、8和14 是肠毒素受体，肠毒素与 claudin受体的初始结合形成约90 kD的“小复合物”。几种小复合物的相互作用导致肠毒素的寡聚化和细胞膜表面形成前孔，最终形成约450 kD的CH－1大复合物，包括六聚体的肠毒素，受体和非受体的claudins。肠毒素β发夹环组装成β桶并迅速插入靶细胞膜从而启动阳离子穿透孔的形成，钙离子通过穿透孔注入细胞从而在肠毒素诱导的细胞死亡中起着关键作用[33]。

5.2 肠毒素引起细胞死亡的作用机制 当用低剂量肠毒素孵育Caco－2细胞时，形成少量的孔随后钙离子适度流入，导致钙蛋白酶活化和凋亡，伴随着细胞色素C释放和细胞凋亡蛋白酶－3活化。然而随着肠毒素剂量的增加，形成更多孔导致大量钙离子的涌入和更强钙蛋白酶活化，导致极小量的细胞凋亡蛋白酶－3活化和与坏死一致的细胞形态变化。延长体外孵育时间加剧了细胞形态变化，导致基底外侧细胞表面外露，从而结合更多的肠毒素并形成约600 kD的更大的复合体CH－2，包括紧密连接蛋白和闭合蛋白[34]。在小鼠和兔子的小肠环中，肠毒素诱导的剂量依赖性组织学损伤表现为严重的绒毛缩短，脱屑以及和坏死特征相一致的上皮细胞变化。在兔结肠中也发生组织学损伤，与先前的体外发现相反，用肠毒素处理小鼠肠环能够诱导剂量和时间依赖性的细胞凋亡蛋白－3的活化。然而这种激活对于肠道病变的发展并不是必需的，因为使用泛半胱天冬酶抑制剂Q－VD－OPh并不能防止肠道损伤或肠毒血症死亡。目前为止尚未进一步探索钙蛋白酶激活的作用和细胞程序性死亡在肠毒素相关疾病中的潜在作用。

6 坏死性肠炎毒素B

6.1 坏死性肠炎毒素B遗传学特性和结构特征坏死性肠炎毒素B基因netB位于名为NELoc1的42 kb致病性基因座上，存在于大的接合质粒上。与β毒素一样，坏死性肠炎毒素B与来自金黄色葡萄球菌的β－PFT（α溶血素）具有部分序列相似性。根据新近的毒素分型方案，坏死性肠炎毒素B由G型魏氏梭菌菌株产生。对于这种毒素的科赫法则已经在鸡疾病模型中得到验证，研究表明坏死性肠炎毒素B是导致禽类坏死性肠炎发展的主要毒力因子，这也得到了强有力的流行病学证据的支持。禽流感坏死性肠炎病例中肠细胞的死亡是由于粘膜固有层、细胞外基质和细胞间连接破坏引起的。坏死性肠炎毒素B形成中心直径约为26的七聚体亲水性孔。然而坏死性肠炎毒素B的特异性受体尚未被鉴定出来[35]。

6.2 坏死性肠炎毒素B引起细胞死亡的作用机制与其他成孔毒素相比，坏死性肠炎毒素B形成的孔允许Na＋、Cl－和Ca2＋的流入并导致渗透细胞的裂解，该毒素诱导LMH细胞的变圆和裂解，随后释放LDH，虽然这与坏死特征相一致，但其涉及的细胞死亡特定途径及在肠道上的作用并没有被深入研究[36]。

7 展 望

过去几年对于魏氏梭菌毒素作用的分子机制进行诸多研究，但主要集中在少数物种，比如马和绵羊为对象研究α毒素的溶血活性，在山羊中ε毒素诱发肠毒素症作用机制。在研究魏氏梭菌感染的发病机理时，宿主和细胞易感性是需要考虑的关键因素，因此魏氏梭菌相关疾病的体外或动物模型的选择应该解决这些变化。由于大多数魏氏梭菌毒素结合并作用于宿主细胞膜上的受体，因此发病早期是治疗魏氏梭菌相关疾病的有效靶标。例如已显示Mepacrine治疗剂通过干扰孔形成和毒素插入来保护肠细胞样细胞免于体外肠毒素作用。目前正在小鼠模型中研究Mepacrine对于肠毒素的潜在作用。大多数魏氏梭菌毒素作用的最终结果是细胞死亡。过去几年通过使用不同的方法，在阐释复杂的细胞内途径方面取得了显著进展。然而在这方面仍存在许多空白，剖析魏氏梭菌毒素和靶细胞之间的复杂相互作用可能会发现其他的药理学靶标。笔者课题组一直从事魏氏梭菌外毒素研究工作，主要集中在对α和β毒素的基因克隆、表达及免疫原性方面的研究，利用定点突变技术不但使其生物学活性发生了改变，而且揭示了其二级和三级结构并且构建的α、β融合蛋白具有良好的免疫原性，从而为预防由魏氏梭菌引起的相关疾病提供了免疫效果良好的基因工程亚单位疫苗。