冷冻治疗的研究

李鸿鹏，李铁军

(1.清华大学医学院，北京 100084； 2.大连医科大学附属第一医院皮肤科，辽宁 大连 116011)

近年来，冷冻治疗已经用于各种皮肤病变的治疗，成为无法通过手术切除实体肿瘤治疗的重要手段。冷冻治疗作为一种新型局部治疗方法，具有消融能力大、消融部位精确等超越射频消融术、热疗等其他治疗方法的优点，可直接通过细胞坏死和凋亡、改变局部微循环和调节免疫等摧毁病变细胞，进而清除皮肤病变和恶性肿瘤。冷冻治疗不良反应少，组织修复治疗效果较好[1]。随着冷冻治疗设备的发展、冷冻消融技术的完善以及临床经验的不断积累，冷冻治疗在皮肤病和肿瘤治疗中占据越来越重要的地位。冷冻治疗的适用领域不断扩展，现通过阐述冷冻治疗设备的发展与制冷剂使用的现状，对目前广泛使用的氩氦刀和新上市的康博刀冷冻治疗原理和特点进行对比，对国内外冷冻治疗的研究予以综述，以期促进冷冻技术治疗效果的提高和治疗领域的扩大。

1 冷冻治疗设备与制冷剂

1.1冷冻治疗设备的发展 目前，临床主要使用由一个储冷罐和一个喷嘴组成的手持液氮喷雾设备，实施皮肤疾病的喷雾冷冻手术。随着冷冻手术的广泛应用，现已开发自动化多探针冷冻设备。1998年美国Endocare公司成功研制出肿瘤治疗设备-美国氩氦刀。在CT或B超引导下将氩氦刀头经皮准确穿入肿瘤组织中心，可籍氩气在刀尖急速绝热制冷使肿瘤组织降至-100 ℃；随即可籍氦气在刀尖急速制热使冰球解冻并急速升温至50 ℃[2]。刘静教授团队联合海杰亚(北京)医疗器械有限公司自主研发出大型肿瘤治疗设备——康博刀。康博刀治疗系统最低温度可达-196 ℃，最高温度可达80 ℃以上[3]。康博刀与氩氦刀都是通过高强度冷热快速切换的方法，达到杀死癌细胞的目的，但康博刀的整体工作性能显著优于氩氦刀，且探针与液氮的成本均较低[4]。目前，各种不同类型的冷冻治疗设备均可用于临床治疗。

1.2制冷剂 虽然液态二氧化碳、一氧化二氮、氟利昂或氩作为制冷剂亦可用于临床治疗，但液氮仍是最常用的现代制冷剂。液态氩是在300个大气压下用焦耳-汤姆逊(Joule-Thomson，J-T)效应冷却探针尖端，即在探头的热交换室中通过1个限制孔的压力来传递气体。在J-T型装置中，液态氩比液态氮的冷却速度快，但温度只有-130～-135 ℃，且冷冻后气体回流会迅速加热探针。在治疗肿瘤的过程中，由于液态氩的冷冻能力较低，相较于液态氮的冷冻直径，液态氩需要2倍的探针才能达到相同冷冻效果。但加压氩气冷却的J-T型装置不需要液氮真空绝缘材料储存罐。氩氦刀属于J-T型装置，在300～500个大气压下工作的氩气为稀有性超高压气体，获取受限，手术实施中存在安全隐患；而康博刀为相变制冷型装置，使用运行压力2～5个大气压的液氮，易于获取，安全性和可操作性好[5]。J-T型设备中常用的另外两种冷冻剂是液态二氧化碳和液态一氧化二氮，虽然已临床使用多年，但缺乏足够用于治疗侵袭性癌症或多探头设备的冷冻能力。

2 冷冻治疗技术

2.1冷冻治疗方法 冷冻治疗方法主要有棉签涂抹、定点喷雾和探针介入3种，前两种方法主要用于治疗各种皮肤病，探针介入主要治疗各种肿瘤。由于病毒可能在液氮中生存而污染制冷剂，故棉签涂抹需要为每例患者单独分配制冷剂，避免交叉传染[6]。此外，棉签涂抹的最大冷冻深度为2～3 mm，故不能用于深层病变的治疗。定点喷雾是使用手持液氮喷雾单元实施的喷雾治疗，主要有直接模式(直接喷洒病变中心)、螺旋模式(从病变的中心螺旋向外)和“画笔”模式(将喷嘴从一侧像漆墙一样移至其他损伤部位)3种方式。手持绝热塑料锥是对定点喷雾治疗方法的改进，将适当大小的圆锥直接放置于病变区域，使制冷剂的喷雾区域限制于尖端暴露的部位，较单独使用喷雾剂的冻结深度加深，制冷剂直接作用于目标组织，可使冷却速度较慢的制冷剂获得深度冷冻和大面积冷冻的治疗效果[7]。圆锥尖端的大小形状各异，可在目标组织形成多种冻块。探针介入是采用探针进行冷冻手术的治疗方法，在肿瘤的深层组织中插入一根或多根探针，冷冻剂通过该针在压力和湍流作用下回收，导致被治疗的肿瘤深层组织内形成冰球，经过2次冻融循环，可消融85%的实体肿瘤，更深层或直径更大的肿瘤则需进行多次冷冻。康博刀与氩氦刀均为探针介入治疗。

2.2冷却速率 冷冻治疗中，快速冷冻(>50 ℃/min的降温速度)只发生在冷冻探针附近，距探针越远冷却速率越低。距喷雾中心约1 cm处，冷却速率只有10～20 ℃/min，且与喷头温度有关。冷冻治疗肿瘤直径>2 cm时，大多数组织不会被快速冷却，但低冷却速率似乎并不改变治疗结果[8]。Farrant和Walter[9]认为，决定细胞生存的主要因素是细胞在不同时间接触到不同的热量变化，而并不是冷却速率。不同病变组织的冷冻时间亦有较大差别。

2.3温度控制 细胞内水体积很小，电解质多样性导致凝固点不同，甚至凝固点可低至-54.9 ℃(氯化钙溶液的最低凝固点)。在肿瘤治疗或其他情况下，必须通过低温保证组织破坏，考虑临床应用的误差范围，-50 ℃对所有肿瘤组织最安全。若使组织处于低于-50 ℃，冷冻持续时间无要求，而冰冻状态(如高于-40 ℃)将会增加组织破坏。组织温度高于-40 ℃时，解冻时间越长，溶质效应和冰晶体生长越明显，对细胞的损伤越强[8]。

2.4冻融循环 反复冻融对肿瘤组织的破坏性更强，但对冷冻融化循环的具体间隔时间目前还未确定。Whittaker[10]在仓鼠口腔黏膜的周期性重复冷冻实验中发现，细胞内冰晶在每次冻融循环的间隔时间中均会增加，从而提出较长间隔时间可增加冷冻效果，较长解冻时间会使细胞内冰晶再晶体化而诱导细胞膜的渗透破坏。同时，持续的解冻将使组织处于低温状态，可为微循环的停滞提供足够的时间。当这一冷冻区域的热量发生损耗，第2个冻融周期将会更加有效。但临床实践中，由于工作量较大，很难等待冰晶完全融解的长时间间隔。总之，最理想的破坏病变组织技术是快速冷冻组织，使其达到适当的低温，通过缓慢解冻延长持续时间，并重复冻融循环。

3 冷冻治疗的简单机制

3.1表观现象 对皮肤病变实施冷冻喷雾时，在20～30 s的冷冻期后立即发生表观变化，显示白色冰场。在融化的几分钟内，冰场边缘的皮肤出现紫红色并集中运动，在皮肤表皮层和深层都与周围健康皮肤有明显界限，随后深层组织变得更苍白，表面形成的出血性水泡逐渐形成疮痂，持续时间2～6周[11]。本质上，低温冷冻和低温喷雾治疗后的变化没有区别，冷冻时立即能够看到冰晶，但当细胞质出现越来越多的嗜酸粒细胞时，第1次的细胞变化被延迟至大约30 min后；冷冻后1 h内，可能没有明显的细胞死亡，但随后几小时内可出现细胞核固缩、细胞质均质化[12]。

3.2细胞坏死与凋亡 细胞坏死或基因调控的细胞死亡(凋亡)是冷冻直接导致细胞损伤的一种机制。Forest等[13]将一种人类肺腺癌细胞注射到小鼠背区的冷冻活体实验研究显示，冷冻区域中心部分坏死，周围区域有凋亡细胞，冷冻后2～8 h内，细胞凋亡逐渐增加，且细胞凋亡发生在坏死区域以外的区域，但两者之间的边界尚不清楚，并在4 d后观察到第2次坏死。体内实验说明了冷冻手术后细胞凋亡的时间，同时也阐明了体外和体内研究的直接联系。细胞凋亡或继发性坏死是由冷冻过程中肿瘤细胞内外微环境的变化导致的，如pH值改变、ATP 酶异常、线粒体损伤、电解质紊乱、细胞器及细胞核破裂等[14]。

3.3直接细胞损伤 冷冻部位镜下显示内质网脱粒。在组织学上，真皮表皮交界处出现水泡，表皮和相关黑色素细胞发生最大程度的死亡。胞外冰晶导致的细胞膜破坏，对固体肿瘤中紧密排列的细胞具有破坏作用。冷冻过程中，许多细胞内形成冰晶，破坏线粒体和内质网。细胞外冰的变化和细胞外水的减少与溶质浓度的增加有关。渗透压的改变会导致细胞溶解、细胞体积减少和细胞膜破裂，其中一些破坏是不可逆转的，且在融化过程中会加剧。尽管许多细胞刚解冻后看起来很正常，但很多细胞已经死亡。大的冰晶比小的冰晶更具破坏性[12]。缓慢融化与冰的再晶化有关，比快速融化更具有破坏性。由于液态氮相对于其他制冷剂解冻缓慢，而缓慢解冻正是增加组织破坏的重要因素，故液态氮冷冻手术在临床实践中最有效。

3.4微循环停滞与再生 温和的冷却会使微血管的流动减少，在冬天皮肤变白时很容易观察到，但这种效应在小动脉较小。液氮冷冻后血管收缩，但在深度冷冻后血管开始扩张，毛细血管和静脉形成微血栓并逐渐固定在内皮细胞上，故最终根本不流动，且可在-15 ℃以下观察到这种效果，由于血小板聚集、血流瘀滞形成微血栓，导致细胞缺血坏死，细胞缺血坏死的程度将取决于冻结深度和横向扩散宽度[15]。临床实践中，静脉和毛细血管可发生堵塞，但大动脉和小动脉很少发生。

组织被冻结，但基质可能没有较大的变化，这种体系结构的保存对于修复非常重要。伤口愈合是活跃的过程，开始由于趋化因子引起的病变边界处的炎症反应，在促炎素、组胺和细胞因子等炎性介质的刺激下，早期发生中性粒细胞浸润，随后是单核细胞，且这种细胞浸润紧随着由冷冻组织的解冻导致的低温和水肿而发生。有学者认为，炎性细胞浸润有助于细胞凋亡和组织破坏的发展[16]。当肉芽组织逐渐形成，成纤维细胞分化成肌成纤维细胞，受损的胶原蛋白被新的胶原蛋白所取代。细胞浸润有助于建立新的微循环系统，对组织的修复过程至关重要[17]。延迟愈合是低温伤口的特征之一，无论是结痂还是吸收，清除坏死组织需要一定的时间。冷冻伤口愈合较切除伤口速度慢，但微循环系统得到了改善。

4 冷冻治疗疾病的现状

4.1皮肤病的冷冻治疗 对皮肤病进行冷冻治疗已经比较普遍，且治愈率较高，复发率在10%左右，见表1[18]。在小的基底和鳞状细胞癌(直径2 cm)治疗中，Kuflik[19]总结了30年4 406种皮肤癌的临床经验发现，冷冻治疗的治愈率达98%。Nordin和Stenquist[20]对5年期间100例外耳冷冻手术治疗结果的研究发现，只有1例复发，并认为外科手术切除后再对病灶进行冷冻治疗是一种安全的治疗方法。

4.2恶性肿瘤的冷冻治疗 大多数肿瘤最好通过手术切除治疗，便于进行外科检查和评估，保守的手术治疗是进行微创和消融治疗(如冷冻手术)。冷冻手术是一种安全有效的治疗多种肿瘤的方法，主要应用于全身各种实体肿瘤，包括肝癌、肺癌、前列腺癌、结直肠癌、胶质瘤、肾癌、骨骼的良恶性肿瘤、黑色素瘤、乳腺癌、胰腺癌、软组织肿瘤、肾上腺癌、

表1 冷冻时间和良性、癌变前皮肤病的治疗结果

脑膜瘤、子宫肌瘤等以及癌症止痛等，现最常用于肝癌和肺癌[21-36]。癌变皮肤主要采用手持液氮喷雾设备治疗，冷冻治疗时间和治疗结果见表2[37]。体内肿瘤冷冻治疗主要是采用氩氦刀和康博刀。我国自1999年引进氩氦刀以来，已有2万多例肿瘤患者接受氩氦刀冷冻消融治疗，有效率达90%以上[38]。冷冻手术的有效率较高，但并不是最优的。有研究表明，氩氦刀联合应用化疗药物或多种免疫疗法可明显提高患者的生存率[39-40]。刘冰和张元昊[41]的研究表明，氩氦刀联合自体细胞免疫疗法治疗肠癌肝转移较单纯冷冻治疗和单纯自体细胞免疫疗法治疗，肝转移灶缩小更明显。Liang等[42]研究表明，在治疗复发性乳腺癌时，冷冻消融术、自然杀伤细胞疗法和赫赛汀组合治疗法联用，较单独冷冻消融术法或冷冻消融术与自然杀伤细胞组合疗法，可更好地降低循环肿瘤细胞水平，减少癌胚抗原和糖类抗原15-3，显著增强免疫功能。我国首创的康博刀已成功完成临床试验，可广泛用于临床实体肿瘤的冷冻治疗，2018年7月13日在北京大学肿瘤医院进行了首例临床应用，目前还未与其他疗法、药物组合[43]。

5 小 结

冷冻治疗适用范围广泛，具有很高的临床应用价值。目前，对冷冻治疗的冷却速率、冷冻治疗机制和适应证治疗效果的研究已经比较充分，尤其是氩氦刀冷冻治疗，而对于应用时间较短的康博刀的临床研究尚不充分。康博刀价格低、运营成本低、整体>AIDS：获得性免疫缺陷综合征工作性能优于氩氦刀，更适合于我国临床推广应用。确定氩氦刀或康博刀联合多种免疫疗法的治疗方案、联合应用药物类型和交付方式以及冷冻时间、复温时间和冻融循环间的时间间隔，对提高临床冷冻治疗效果至关重要，但仍有待进一步深入研究。此外，冷冻治疗手术后，细胞破坏释放组织抗原导致的免疫耐受也亟待解决。冷冻免疫应答的深入研究，主要是细胞因子释放和T细胞分化对基因层面表达的变化和相关信号通路的研究，对冷冻治疗本质的认识具有重要意义。

表2 冷冻时间和癌变皮肤的冷冻治疗结果