齿毛菌原生质体的制备与转化

王正娟，苏柳如，叶秀云，林 娟，杨 捷

(福州大学生物科学与工程学院，福建省海洋酶工程重点实验室，福建 福州 350108)

0 引言

齿毛菌属(Cerrenasp.)隶属担子菌纲(Bssidiomycetes)多孔菌目(Aphyllophorales)多孔菌科(Polyporaceae)，作为一种药用真菌，它的次生代谢产物具有调节免疫、抗氧化、抗病毒、抗癌等生物活性，同时能高效分泌漆酶[1].漆酶(Laccase，EC1.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶，可催化酚类、多环芳烃类、甾体激素、生物色素等多种底物氧化，将电子转移至分子氧，生成唯一的副产物水分子[2].漆酶作为一种高效、环保的生物催化酶类，在纺织、造纸、食品、有机物合成、生物降解、环境修复等领域具有重要应用价值[3].

虽然担子菌纲白腐真菌是最主要的漆酶生产者[4]，但是真菌漆酶的产量在不同种属和菌株有所不同，大部分野生型菌株漆酶产量低，产酶周期长[3].因此，对产漆酶菌株的产酶机制进行解析及改造，获得漆酶高产菌株对生产实践具有重要意义.

丝状真菌常见的遗传改造方法，如紫外诱变、基因导入、农杆菌转化等由于细胞壁的存在导致改造效率低[5].因此既无细胞壁阻碍、又保持细胞完整性且具有优良再生性能的原生质体转化法成为了丝状真菌遗传转化的优先选择.原生质体转化法已被广泛应用于多种真菌的遗传操作中，如重伞灵芝(Ganodermamultipileum)[6]、炭黑曲霉菌(Aspergilluscarbonarius)[7]、黑粉菌(Ustilagoesculenta)[8]等.但是由于不同菌株的细胞壁组成有很大不同，甚至同一菌株不同部位的组成也有所不同，因而原生质体的制备没有标准化的方法，也没有普遍适用的原生质体转化法[9].

实验室前期获得的Cerrenasp.HYB07菌株，具有漆酶产量高，产酶周期短的特性.本实验以该菌株为研究对象，潮霉素B抗性基因Hyg作筛选标记，探究影响齿毛菌原生质体制备及再生的多个重要因素，建立PEG介导的原生质体遗传转化体系，以获得稳定遗传的转化菌株.

1 材料与方法

1.1 材料

齿毛菌Cerrenasp.HYB07菌株，由福建省海洋酶工程重点实验室保藏； pCAMBIA1302质粒，该质粒携带有潮霉素B磷酸转移酶基因(hygromycin B phosphotransferase,Hyg)和绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因.

1.2 试剂

溶壁酶购自广东微生物研究所； 潮霉素B购自瑞士Roche公司； 真菌DNA提取试剂盒购自美国OMEGA公司； 2×Easy Taq PCR SuperMix购自北京全式金生物技术有限公司； 其余试剂均为分析纯.

1.3 原生质体制备

1) 培养基制备.PDA培养基参考文献[10]制备.YSJ培养基[11]： 麦芽糊精60 g，蛋白胨15 g，KH2PO46 g，MgSO4·7H2O 4.14 g，CaCl20.3 g，NaCl 0.18 g，CuSO4·5H2O 0.062 5 g，ZnSO4·7H2O 0.018 g，VB10.015 g，定容至1 L，pH值范围4.5～4.8，121 ℃，灭菌30 min.

再生培养基1号： PDA培养基添加稳渗剂至终浓度为0.8 mol·L-1，121 ℃，灭菌20 min； 再生培养基2号： YSJ培养基添加稳渗剂至终浓度为0.8 mol·L-1，121 ℃，灭菌20 min； 再生培养基3号[12]： 马铃薯葡萄糖水24 g，酵母粉2 g，蛋白胨2 g，蔗糖10 g，KH2PO40.46 g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，VB10.2 g，琼脂粉15 g，添加稳渗剂至终浓度为0.8 mol·L-1，定容至1 L，121 ℃，灭菌20 min.

2) 菌丝培养方法.取PDA斜面保藏菌种，PDA平板划线30 ℃活化培养4 d，以直径0.5 cm打孔器打孔，取3个菌饼至50 mL PDA一级种子液，30 ℃、200 r·min-1培养2 d； 以6%～8%的接种量接一级种子液至100 mL二级种子液，30 ℃、200 r·min-1培养2 d.

3) 原生质体制备.取30 mL培养2 d的二级种子液于50 mL无菌离心管中，4 ℃、12 000 r·min-1离心15 min，弃上清； 无菌水洗涤一次； 稳渗剂洗涤一次； 无菌滤纸滤干水分； 准确称取0.2 g菌丝于4 mL离心管中，加入2 mL一定质量浓度溶壁酶(稳渗剂溶解溶壁酶干粉，0.22 μm无菌滤膜过滤)，在一定温度下80 r·min-1振荡酶解一定时间； 无菌注射器(内塞有灭菌脱脂棉)过滤除菌丝，滤液在4 ℃、8 000 r·min-1离心10 min，弃上清； 沉淀用稳渗剂重悬洗涤2次； 加1 mL 0.6 mol·L-1的甘露醇重悬原生质体.

4) 原生质体再生.显微镜下用血球计数板计数原生质体悬液中的原生质体形成数(M)，取0.1 mL原生质体悬液轻轻涂布于再生培养基平板上，30 ℃暗箱培养6～8 d，菌落长出后计数平板菌落数(A).同时，以用无菌水稀释的原生质体悬液为对照组，计数再生平板菌落(B).

5) 不同因素对原生质体制备及再生的影响.采用不同菌龄(24、36、48、60、72 h)的二级种子液菌丝为原料； 选用不同种类稳渗剂(0.6 mol·L-1甘露醇、0.6 mol·L-1蔗糖、0.6 mol·L-1KCl)； 以不同质量浓度(10、15、20、25、30 mg·mL-1)溶壁酶，在不同温度(20、25、30、35、40 ℃)下，酶解不同时间(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h)制备原生质体； 并在不同种类再生培养基(1、2、3号)上再生培养.探索不同因素对齿毛菌原生质体制备及再生的影响.

1.4 原生质体转化

1) 潮霉素B敏感性实验.原生质体转化前配制含有0、10、20、30、40、50 μg·mL-1潮霉素B的PDA平板，涂布1 000 μL齿毛菌二级种子液菌丝，30 ℃恒温培养6 d后观察菌丝生长情况，以确定潮霉素B对齿毛菌HYB07的最低抑制浓度.

2) 齿毛菌原生质体转化.参照Subburaj 等[13]和Yu等[8]的原生质体转化方法，并加以改良.将新鲜制备的原生质体悬浮于MTC(0.6 mol·L-1甘露醇，10 mmol·L-1Tris-HCl、pH值为6，10 mmol·L-1CaCl2)缓冲液中，使原生质体数目为1×108个·mL-1； 每100 μL MTC原生质体悬浮液加入1 μg线性化质粒pCAMBIA1302、50 μL PEG缓冲液(400 mg·mL-1PEG 4000以MTC缓冲液溶解，0.22 μm无菌滤膜过滤)，冰浴30 min； 加入1 mL PEG缓冲液，25 ℃水浴15 min.将混合液加入5 mL液体再生培养基中，30 ℃、120 r·min-1培养12 h后涂布于含最低抑制浓度潮霉素B的再生平板上； 30 ℃培养，待菌落再生后挑取单菌落于潮霉素B抗性PDA平板上复筛.

3) 齿毛菌转化子鉴定.挑取在复筛平板上生长的拟转化子单菌落进行种子液培养，以未转化齿毛菌为对照.收集二级种子液菌丝，采用OMEGA试剂盒提取基因组DNA.以基因组DNA为模板，PCR扩增Hyg和GFP基因，扩增片段大小分别为1 026 bp和750 bp.Hyg基因上游引物Hyg-F： CTATTTCTTTGCCCTCGGAC，Hyg基因下游引物Hyg-R： ATGAAAAAGCCTGAACTCACC；GFP基因上游引物GFP-F： GATCTGACTAGTAAAGGAGAAGAAC，GFP基因下游引物GFP-R： TCACACGTGGTGGTGGTGGT.引物由上海Invitrogen有限公司合成.反应条件： 94 ℃预变形5 min，94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环，72 ℃延伸10 min.

2 结果与讨论

2.1 原生质体制备及再生

2.1.1 菌龄对齿毛菌原生质体制备及再生的影响

不同菌龄的菌丝，其细胞壁结构组成有所不同，对酶的敏感程度也不同，故原生质体制备时形成数目也不同.幼嫩菌丝的细胞壁易被酶解形成原生质体，但并非菌丝越幼嫩越利于酶解[12].选取不同菌龄的菌丝制备原生质体，原生质体形成数和再生率如图1所示.由图1结果可知，随着菌龄增大，原生质体形成数和再生率也随之增加，48 h菌龄的原生质体形成数和再生率最高； 随着菌龄继续增大，原生质体形成数和再生率迅速下降.因此该齿毛菌原生质体形成及再生的最佳菌龄为48 h.卢明峰等[14]制备丝状真菌AL18原生质体时的最佳菌龄亦为48 h，与本实验结果一致.

2.1.2 稳渗剂对齿毛菌原生质体制备及再生的影响

真菌细胞壁被破坏后形成的原生质体需悬浮于高浓度稳渗剂中维持原生质体细胞膜内外渗透压平衡.菌株种属不同，所适应的稳渗剂种类亦不同.不同种类的稳渗剂对原生质体形成数及再生率的影响如图2所示.图2结果表明，不同种类稳渗剂对齿毛菌原生质体形成数和再生率的影响明显不同.其中，原生质体制备数： 甘露醇>KCl>蔗糖； 再生率： 蔗糖>甘露醇>KCl.虽然以甘露醇做稳渗剂时原生质体的形成数最多，但再生率并不是最高.而蔗糖作稳渗剂时尽管原生质体形成数最少，但是其再生率却最高.由此可知，以甘露醇作稳渗剂时原生质体的制备效果最佳； 以蔗糖作稳渗剂时原生质体的再生效果最佳.

图1 不同菌龄对原生质体制备及再生的影响Fig.1 Effect of different hypha on protoplast’s production and regeneration

图2 不同稳渗剂对原生质体制备及再生的影响Fig.2 Effect of different osmoticum on protoplast’s production and regeneration

糖类、糖醇类、无机盐类等多种稳渗剂被用于真菌原生质体制备.虽然一般认为无机盐类适用于丝状真菌，糖类和糖醇类适用于酵母和高等植物，但是目前无法确切解释某种化学试剂作为稳渗剂适用于某一特定菌株[9].孙墨可等[15]的研究表明在灵芝(Ganodermalingzhi)原生质体制备时，以0.4 mol·L-1甘露醇作稳渗剂时原生质体产量最高.卢明峰等[14]在丝状真菌AL18原生质体制备及再生的研究中发现，以0.6 mol·L-1MgSO4·7H2O作为稳渗剂时原生质体形成数最佳，而以0.6 mol·L-1蔗糖作稳渗剂原生质体再生效果最好.表明原生质体制备及再生的最适稳渗剂种类不一定一致，这与本研究结果相同.蔗糖作为稳渗剂利于原生质体的再生，可能是它不单维持渗透压平衡，还可为原生质体再生提供碳源.

2.1.3 溶壁酶质量浓度对齿毛菌原生质体制备及再生的影响

真菌细胞壁主要由纤维素、半纤维素、葡聚糖、甘露聚糖、几丁质、蛋白质及脂类等组成[16].溶壁酶可破坏细胞壁结构，释放原生质体.适当的溶壁酶质量浓度对原生质体形成具有重要影响.溶壁酶质量浓度过高，会破坏原生质体细胞膜，从而影响原生质体再生； 溶壁酶质量浓度太低，原生质体形成数少，原生质体再生率低[5].不同质量浓度溶壁酶对原生质体形成数和再生率的影响如图3所示.由图3可知，原生质体形成数和再生率都随溶壁酶质量浓度的增加呈现先增加后下降的趋势.溶壁酶质量浓度为20 mg·mL-1时原生质体形成数最多，再生率也最高，故原生质体制备及再生的最佳溶壁酶质量浓度为20 mg·mL-1.陈鹏等[17]研究表明用20 mg·mL-1溶壁酶制备金针菇(Flammulinavelutipes)原生质体的形成数最多，与本实验结果一致.

2.1.4 酶解温度对齿毛菌原生质体制备及再生的影响

酶解温度直接影响酶促反应速率.不同菌株具有不同的最适酶解温度，过高或过低都会影响酶活性，亦会影响原生质体形成及再生.不同酶解温度对原生质体形成数和再生率的影响如图4所示.由图4可知，随酶解温度的升高，原生质体制备数和再生率也随之上升，当酶解温度到达30 ℃时，原生质体制备数和再生率达最高.随酶解温度的继续升高，原生质体制备数和再生率锐减.故齿毛菌原生质体制备及再生的最佳酶解温度为30 ℃.

图3 不同溶壁酶质量浓度对原生质体制备及再生的影响Fig.3 Effect of different lywallzyme mass concentration on protoplast’s production and regeneration

图4 不同酶解温度对原生质体制备及再生的影响Fig.4 Effect of different enzymolysis temperature on protoplast’s production and regeneration

邢振楠等[18]用溶壁酶裂解香菇(Lentinulaedodes)菌丝，酶解温度为30 ℃时，原生质体制备及再生效果最佳.陈鹏等[17]利用溶壁酶制备金针菇(Flammulinavelutipes)原生质体，酶解温度为26 ℃时，原生质体制备率最高.因此溶壁酶作用于不同菌株，其最适酶解温度亦有所不同.

2.1.5 酶解时间对齿毛菌原生质体制备及再生的影响

适当的酶解时间也是影响原生质体制备的重要因素之一.酶解时间过短，细胞壁裂解不完全； 时间过长，细胞膜受损伤，原生质体破裂[19].不同酶解时间对原生质体形成数和再生率的影响如图5所示.由图5可知，随酶解时间的逐渐增加，原生质体形成数和再生率亦逐渐升高.当酶解时间为3 h时，原生质体形成数和再生率最高； 之后随酶解时间的延长，原生质体形成数和再生率都明显下降.因此，3 h为原生质体制备及再生的最佳酶解时间.

陈鹏等[17]研究表明，金针菇(Flammulinavelutipes)以20 mg·mL-1溶壁酶酶解4 h，原生质体制备率最高.卢月霞等[20]利用溶壁酶制备鸡腿菇(Coprinuscomotus)原生质体，酶解时间为3 h时，原生质体形成数最多.可见，不同菌株原生质体制备的最适酶解时长不同.

2.1.6 再生培养基对齿毛菌再生的影响

本实验以甘露醇为稳渗剂制备原生质体，以蔗糖为稳渗剂配制1、2、3号3种再生培养基对原生质体进行再生培养，结果如图6所示.图6结果表明在2号再生培养基中原生质体再生率最高，3号再生培养基次之，1号再生培养基再生率最低.可能是2号再生培养基富含碳源氮源及微量元素，有利于齿毛菌的再生.

图5 不同酶解时间对原生质体制备及再生的影响Fig.5 Effect of different enzymolysis duration on protoplast’s production and regeneration

图6 不同再生培养基对再生的影响Fig.6 Effect of different regeneration medium on protoplast’s production and regeneration

2.2 齿毛菌原生质体转化

2.2.1 潮霉素B敏感性测试

真菌遗传转化体系中，以抗生素抗性做筛选标记时，受体菌株对抗生素的敏感性十分重要.潮霉素B对大多数真菌都有较强的抑制作用，因此真菌遗传转化过程中常选择携带潮霉素B抗性基因的载体进行转化，选择合适的潮霉素B质量浓度对转化子进行初筛和复筛.不同菌株对潮霉素B的敏感性不同.孙墨可等[15]研究表明，灵芝(Ganodermalingzhi)的潮霉素B最小受抑制质量浓度为40 μg·mL-1； 李刚等[21]研究表明赤灵芝(Ganodermalucidum)原生质体转化过程中，菌丝受100 μg·mL-1潮霉素B的抑制； Stephan 等[22]筛选双色蜡蘑(Laccariabicolor)转化子时的潮霉素B质量浓度为300 μg·mL-1.

实验中，齿毛菌菌丝在潮霉素B质量浓度为10、20 μg·mL-1的PDA平板上生长缓慢，在潮霉素B质量浓度为30 μg·mL-1的PDA平板上生长极缓慢，在潮霉素B质量浓度为40、50 μg·mL-1的PDA平板上生长完全受抑制.因此，确定齿毛菌菌丝生长最小受抑制潮霉素B质量浓度为40 μ·mL-1，本实验选用齿毛菌转化实验的筛选抗性为40 μg·mL-1潮霉素B.

2.2.2 原生质体转化

PEG介导质粒pCAMBIA1302转化齿毛菌原生质体后，涂布于含40 μg·mL-1潮霉素B的2号再生平板上，30 ℃暗箱培养7 d再生出菌落.挑取再生单菌落至含40 μg·mL-1潮霉素B的PDA平板上，以未转化的齿毛菌为对照.转化子因携带有潮霉素B抗性基因，能够在40 μg·mL-1潮霉素B的抗性平板上正常生长，而未转化菌株无法生长.挑取在40 μg·mL-1潮霉素B的抗性平板上生长良好的菌株，转接至含50 μg·mL-1潮霉素B的抗性平板上进行复筛.

2.2.3 转化子PCR鉴定

挑取复筛平板上生长良好的菌株在抗性平板上划线扩大培养，收集二级种子液菌丝提取基因组DNA，PCR扩增Hyg和GFP基因验证转化子.阳性转化子携带Hyg和GFP基因，阴性对照(未转化菌株)无Hyg和GFP基因.从40个拟转化子中最终验证获得两个阳性转化子，PCR验证结果如图7所示.1号和2号转化子均出现1 026 bp大小的Hyg基因条带和750 bp大小的GFP基因条带，与质粒pCAMBIA1302阳性对照条带大小一致，而阴性对照未出现条带，表明质粒被成功转入齿毛菌中.

Jiang等[23]研究发现，在立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)的遗传转化中，以潮霉素为抗性标记时，未转化菌株出现了较高的耐药性，这可能与其分泌的漆酶相关.漆酶能够降解多种化合物，对多种抗生素也具有降解作用[24].本实验转化子鉴定时假阳性率较高，可能与齿毛菌高效分泌漆酶，导致出现耐药性有关.也可能是由于菌丝簇的存在，使未转化菌株对潮霉素的耐受性提升，故在抗性平板上生长.

2.2.4 转化子遗传稳定性检测

阳性转化子，在无抗性PDA平板连续传代5次，一次时长为5 d，最后转接到含50 μg·mL-1潮霉素B抗性的PDA平板培养基上点种培养4 d，结果如图8所示.1号和2号阳性转化子经过5次传代后，在含50 μg·mL-1潮霉素B抗性培养基上生长良好，而未转化的HYB07菌株则不能生长，由此可知转化子对潮霉素B仍具有抗性.通过此方法验证表明潮霉素B基因随机插入突变体在有丝分裂过程中稳定遗传.

图8 阳性转化子遗传稳定性Fig.8 Genetic stability of positive transformants

孙墨可等[15]利用PEG成功对灵芝(Ganodermalingzhi)原生质体进行了转化，其转化率为每微克质粒DNA转化3～4个转化子； 李刚等[21]通过PEG介导外源基因转入赤灵芝(Ganodermalucidum)原生质体中，其转化效率为每微克质粒DNA转化5～6个转化子； Chou等[6]利用PEG介导重伞灵芝(Ganodermamultipileum)原生质体转化的转化率仅为每微克质粒DNA转化0.1个转化子.可见多孔菌科真菌原生质体转化效率较低，原生质体转化效率可能与菌体种特异性相关.另有研究表明，裂褶菌属(Schizophyllumcommune)富含AT的区域可能影响转化子获得潮霉素B抗性基因[25]； 灰盖鬼伞菌(Coprinopsiscinerea)中N末端的两个氨基酸残基可能抑制潮霉素B基因的表达[26].可见种属特异性使获得潮霉素抗性基因的难易程度也不同.因此在后续实验中，还需要对齿毛菌原生质体转化的条件做进一步优化，从而降低假阳性比率，提升转化效率.

3 结语

齿毛菌以0.6 mol·L-1甘露醇为稳渗剂，20 mg·mL-1溶壁酶于30 ℃酶解2 d菌龄的菌丝3 h，其原生质体形成数可达1×108个·mL-1.以甘露醇为稳渗剂，最优条件下制备的原生质体，在以蔗糖为稳渗剂的2号再生培养基中再生率最高，为0.1%.利用PEG介导齿毛菌原生质体转化，在40 μg·mL-1潮霉素B抗性平板上成功筛选到稳定遗传的转化子，成功建立了齿毛菌原生质体遗传转化体系.该遗传转化方法的建立可为齿毛菌的基因改造、漆酶生产调控机制、次生代谢药物合成机理等研究提供技术支持.