配伍对半夏-厚朴药对中相关化学成分溶出的影响研究△

袁海建，刘玉梅a，刘兴勇，张光际，李卫星，姜俊*，孙娥，陈靖靖

1.泰州职业技术学院，江苏 泰州 225300；2.国家中医药管理局 中药释药系统重点研究室，江苏 南京 210028

半夏为天南星科植物半夏Pinelliaternata(Thunb.) Breit.的干燥块茎，具有抗肿瘤、止咳、抗炎等药理作用[1]。厚朴为木兰科植物厚朴MagnoliaofficinalisRehd.etWils的干燥树皮(干皮、根皮及枝皮)，具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎等药理作用[2]。半夏-厚朴药对出自《金匮要略》记载的半夏厚朴汤，在该复方中两药相须相使，达到药效叠加的目的[3]。在半夏厚朴汤中该药对的配伍比例为4∶3，总用药质量为21 g。

虽然半夏、厚朴单味药材的化学成分[4]和药理研究[5-7]已经取得一定进展，但关于不同配伍比例对该药对中厚朴化学成分影响的研究相对较少。故本实验拟先以半夏-厚朴经典配伍比例4∶3为基准，采用等比递增(减)法设置半夏-厚朴药对不同配伍比例(0∶1、1∶6、2∶5、3∶4、3.5∶3.5、4∶3、5∶2、6∶1、1∶0，下同)，建立其HPLC分析方法，利用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》对药对不同配伍比例的指纹图谱进行评价，确定34个共有峰，观察不同配伍比例下厚朴6个活性成分(厚朴酚、和厚朴酚、绿原酸、紫丁香苷、木兰花碱、金丝桃苷)、7个未知成分溶出量的变化情况，为深入研究药对配伍比例对厚朴相关成分的影响，推测分析药对配伍合理性提供有益探索。

1 材料

1.1 仪器

Agilent 1260LC型高效液相色谱仪(四元梯度泵、自动进样器、柱温箱和DAD检测器)；Agilent ZORBAX SB C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；MS150DU十万分之一电子天平(梅特勒-托利多公司)；KH2200E型超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)；乙腈、甲醇均为色谱纯(购自TEDIA)；磷酸(购自阿拉丁)；纯净水(娃哈哈集团)；0.2%磷酸缓冲溶液(自配)。

1.2 材料

对照品厚朴酚(批号：161205，纯度≥98%)、和厚朴酚(批号：161029，纯度≥98%)、绿原酸(批号：161223，纯度≥98%)、紫丁香苷(批号：GR-134-170104，纯度≥98%)、木兰花碱(批号：GR-134-170303，纯度≥98%)、金丝桃苷(批号：GR-133-161106，纯度≥98%)皆购自南京广润生物制品有限公司。

姜厚朴(产地：四川，批号：160201，泰州德新元大药房)、半夏(泰州市高港中药饮片有限公司，批号：20180312)经泰州市中医院王姝梅主任药师鉴为厚朴、半夏正品。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Agilent ZORBAX SB C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈(A)-0.2%磷酸溶液(B)梯度洗脱：0～4 min，10%～30%A；4～7 min，30%～36%A；7～8 min，36%～78%A；8～12 min，78%～80%A；12～14 min，80%～90%A；14～19 min，90%～99%A；19～20 min，99%～10%A；检测波长：225 nm；柱温：30 ℃；流速：1 mL min-1；进样量：5 μL。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取厚朴酚11.00 mg、和厚朴酚11.50 mg、绿原酸2.70 mg、紫丁香苷20.00 mg、木兰花碱15.00 mg、金丝桃苷5.00 mg，置于5 mL容量瓶中用甲醇溶解并稀释至刻度；制得含厚朴酚2.20 mg mL-1、和厚朴酚2.30 mg mL-1、绿原酸0.54 mg mL-1、紫丁香苷4.00 mg mL-1、木兰花碱3.00 mg mL-1、金丝桃苷1.00 mg mL-1的混合对照品储备液。置于4 ℃下保存，备用。

2.3 供试品溶液的制备

按不同配伍比例各称取半夏、厚朴药材，总质量均为21 g，加入8倍量的80%乙醇水，温度60 ℃，水浴加热回流90 min，过滤，放冷，补足减失质量，定容至175 mL，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，备用。

2.4 线性曲线绘制

精密移取厚朴酚、和厚朴酚、绿原酸、紫丁香苷、木兰花碱、金丝桃苷混合对照品储备液各0.02、0.10、0.28、0.46、0.64、0.82、1.00 mL；分别置于5 mL量瓶中用流动相稀释至刻度，摇匀，制成系列浓度混合对照品溶液，注入液相色谱仪，按2.1项下色谱条件进样分析，见图1。

注：1.紫丁香苷；2.绿原酸；3.木兰花碱；4.金丝桃苷；5.和厚朴酚；6.厚朴酚。图1 厚朴6个活性成分混合对照品色谱图

以对照品溶液浓度为自变量(X)，峰面积为因变量(Y)，进行回归，得到6个对照品的回归方程分别为：紫丁香苷Y=719.12X+53.87，线性范围0.080 0～4.000 0 mg mL-1，r=0.999 4；绿原酸Y=2 115.5X+54.79，线性范围0.010 8～0.540 0 mg mL-1，r=0.999 0；木兰花碱Y=2 767.6X+129.89，线性范围0.060 0～3.000 0 mg mL-1，r=0.999 3；金丝桃苷Y=1073.2X+29.192，线性范围0.020 0～1.000 0 mg mL-1，r=0.999 0；和厚朴酚Y=7 961.7X+368.7，线性范围0.046 0～2.300 mg mL-1，r=0.999 2；厚朴酚Y=10 512X+243.86，线性范围0.044 0～2.200 0 mg mL-1，r=0.999 1。

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度试验 精密吸取2.4项下混合对照品溶液(含紫丁香苷0.080 0 mg mL-1；绿原酸0.010 8 mg mL-1；木兰花碱0.060 0 mg mL-1；金丝桃苷0.020 0 mg mL-1；和厚朴酚0.046 0 mg mL-1；厚朴酚0.044 0 mg mL-1)，按2.1项下色谱条件连续进样5次，记录各对照品峰面积，计算各对照品峰面积的RSD分别为0.65%、0.87%、0.30%、0.55%、0.18%、0.22%，说明仪器精密度较好。

2.5.2 稳定性试验 取1∶6配伍比例的两药材，按2.3项下所述方法制备，在室温下放置0、4、8、12、24 h，按2.1项下色谱条件测定，记录各对照品峰面积，计算各对照品峰面积的RSD值分别为2.84%、2.79%、1.43%、1.02%、0.56%、0.60%，表明供试品溶液在室温条件下至少24 h内稳定。

2.5.3 重复性试验 取1∶6配伍比例的两药材，按2.3项下所述方法平行制备5份，按2.1项下色谱条件测定，计录各对照品峰面积，计算各对照品峰面积RSD值分别为1.07%、1.94%、1.43%、1.02%、0.56%、0.60%，表明本法重复性良好。

2.6 指纹图谱的建立

2.6.1 药对指纹图谱建立和厚朴共有峰确定 按2.3项下供试品制备方法平行制备药对不同配伍比例供试液各6份，按2.1项下色谱条件测定，依据国家药典委员会颁布《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.130723版本)》，以厚朴单味药材(配伍比例0∶1)的指纹图谱为参照谱图，采用中位数法，时间窗口设为0.1，经多点校正和峰匹配，开展药对不同配伍比例指纹图谱相似度评价，确定共有峰34个，见图2；计算药对各配伍比例项下6份供试品中各峰的保留时间、峰面积平均值和保留时间RSD，见表1。

注：6.紫丁香苷；9.绿原酸；11.木兰花碱；16.金丝桃苷；26.和厚朴酚；28.厚朴酚。 图2 不同配伍比例药对HPLC指纹图谱

由表1中可知，34个共有峰相对保留时间RSD均<0.9%，说明不同配伍比例中各成分的出峰时间稳定。

2.6.2 共有峰中考察峰的选择 采用2.6.1项下指纹图谱相似度评价法生成对照图谱R，见图3(色谱峰编号参照图2中顺序)。通过与对照品图谱比对，峰6、9、11、16、26、28分别为紫丁香苷、绿原酸、木兰花碱、金丝桃苷、和厚朴酚、厚朴酚，为活性成分(峰)。另选取共有峰中单峰面积大于总峰面积0.5%、相对保留时间RSD<0.35%的成分1(tR=2.361)、成分3(tR=2.718)、成分12(tR=6.324)、成分15(tR=6.835)、成分17(tR=7.333)、成分22(tR=10.405)、成分27(tR=13.224)7个成分，为未知成分(峰)。

表1 不同配伍比例药对共有峰保留时间①和峰面积②

注：按数据统计量，①为n=48；②为n=6；③为n=48。

图3 半夏-厚朴药对提取液对照指纹图谱

2.6.3 计算活性成分含量及其变化百分率 将表1中0∶1配伍比例项下各活性成分平均峰面积代入2.4项下回归方程算得各活性成分含量(mg mL-1)，再根据公式(1)，计算各活性成分药材含量理论值(mg g-1)。按2.3项下供试品制备方法平行制备药对不同配伍比例供试品各3份，按2.1项下色谱条件测定，记录各活性成分峰面积，据2.4项下回归方程算得各活性成分含量(mg mL-1)后再依公式(1)计算，为各活性成分药材含量实测值(mg g-1)。根据公式(2)计算各活性成分含量变化百分率，结果见表2。

药材含量=算得含量(mg mL-1)×175(mL)/药材用量(g)

(1)

含量变化百分率=(实测值-理论值)/理论值×100%

(2)

2.6.4 变化百分率影响判断依据 参照文献[9]，变化百分率<5%，属于误差范围，认为该配伍比例对厚朴该成分溶出没有影响；5%≤变化百分率≤10%，认为该配伍比例对厚朴该成分溶出有影响；变化百分率>10%，认为该配伍比例对厚朴该成分溶出有显著影响。

由表1、2可知，半夏中不含紫丁香苷等已知成分。通过计算含量变化百分率，紫丁香苷在半夏用量为15 g时溶出变化属误差范围，半夏的用量分别为3、10.5、18 g时显著抑制厚朴活性成分的溶出，与此同时半夏用量为6、9 g时显著增加厚朴活性成分溶出，在试验条件下整体表现出 “抑制→促进→抑制”的趋势。在半夏用量分别为3、15 g时，绿原酸的溶出变化属误差范围，在2∶5～4∶3配伍比例范围内半夏的使用均可增加其溶出；与此类似的是，除了半夏用量达到18 g时会显著抑制厚朴酚溶出外，在半夏存在的其他剂量情况下，均显著增加厚朴酚溶出，上述2种成分在试验条件下，表现出半夏促进其溶出的大体趋势。在半夏配伍用量≤12 g的各配伍比例下，木兰花碱溶出变化均属误差范围，而半夏其他配伍剂量均可显著抑制木兰花碱溶出；在配伍使用的全部剂量范围内，半夏的存在都会对金丝桃苷的溶出表现较显著抑制作用；除了在半夏用量为3、10.5 g时可轻微增加和厚朴酚溶出外，在半夏配伍使用的其他剂量下，和厚朴酚的溶出也均表现不同程度的抑制作用，上述3种成分在试验条件下，表现出半夏抑制其溶出的整体趋势。上述结果也可从含量变化百分率合计Ⅰ得到初步验证。

2.6.5 未知成分峰面积及其变化百分率计算 将表1中0∶1配伍比例项下各未知成分平均峰面积代入公式(3)，为未知成分药材峰面积理论值。按2.3项下供试品制备方法平行制备药对不同配伍比例供试品各3份，按2.1项下色谱条件测定，记录各未知成分峰面积再依公式(3)计算，为各未知成分药材含量实测值。根据公式(4)计算各未知成分峰面积变化百分率，结果见表3。

表2 不同配伍比例药对中厚朴活性成分含量及其变化百分率(n=3)

注：*含量低于线性范围；#因含量低于线性范围而无法计算其含量变化百分率；—未计算；变化百分率合计Ⅰ=∑9个不同比例组该物质变化百分率，变化百分率合计Ⅱ=∑该配伍比例项下所有被测物质变化百分率(下同)。

表3 不同配伍比例药对中厚朴未知成分峰面积及其峰面积变化百分率(n=3) %

未知成分药材峰面积=该未知成分峰面积/该配伍比例下厚朴药材用量(g)

(3)

峰面积变化百分率=(药材峰面积实测值-药材峰面积理论值)/药材峰面积理论值×100%

(4)

由表1、3可知，半夏-厚朴配伍比例1∶0不含本研究考察的未知成分。通过计算峰面积变化百分率，成分12在半夏加入的情况下整体表现出被抑制的趋势；与此正好相反的是成分27，半夏的加入促进了厚朴活性成分的溶出，总体而言半夏的加入对上述2种未知成分的影响较大。成分1、成分3随半夏的加入大体表现出“抑制→促进”的趋势，但略有不同：成分1在半夏用量达到最大时(18 g)才促进溶出，成分3在半夏-厚朴配比4∶3峰面积变化百分率即开始由负变正，逐渐体现出促进溶出的作用。随着半夏的加入，成分17和成分22的溶出大体表现出“促进→抑制→促进”的特点，但半夏对成分22的促进溶出作用弱于对成分17的作用，且随着半夏用量的增加成分22的溶出又趋向于被抑制。半夏的加入对成分15的影响并未表现出较明显的规律性。上述结果也可从峰面积变化百分率合计Ⅰ得到初步验证。

3 讨论

虽然直接将复方药物配伍比例用于药对配伍研究还有待商榷，但为了便于建立基准、开展分析，本研究还是以半夏厚朴汤中半夏-厚朴君臣配伍比例4∶3为基准，按等比递增(减)设置了其他8个剂量组。同时，中药(复方)发挥药效是多种成分共同作用的结果，笔者认为以半夏-厚朴指纹图谱开展相关研究比较有利，因此研究除了选择指纹图谱中属于厚朴的6个有活性的对照品外，还依据《中华人民共和国药典》指纹图谱研究中的规定(任意单个杂质峰面积应不大于总峰面积的0.5%)，选择属于厚朴且单峰面积大于总峰面积0.5%、相对保留时间RSD<0.15%的7个未知成分峰进行综合分析讨论。

厚朴中含有多个厚朴酚结构类似化合物[9]，见图4。从色谱图及表2的含量变化百分率结果可以看出，和厚朴酚的含量在变化百分率Ⅰ总体呈减少趋势，厚朴酚含量在变化百分率Ⅰ总体呈增加趋势。但在随后进行的半夏+厚朴酚对照品、半夏+和厚朴酚对照品的试验中，并未得到“厚朴酚和厚朴酚”相互间变化的证据。

如果某比例项下总溶出量减少(即变化百分率合计Ⅱ减少)而个别成分溶出量却增加，是否可以认为配伍后更有利于发挥溶出量增加成分的药理活性/药效？从表2结果来看，存在上述情况的配伍比例为1∶6、4∶3和5∶2。以4∶3为例，厚朴酚和绿原酸的溶出量同时增加；据药理学研究表明，厚朴酚具有抗炎、抗抑郁、抗溃疡、脑缺血再灌注损伤保护、抗肿瘤等作用[10-11]，绿原酸具有抗炎、抗氧化、免疫调节、心血管保护、抗肿瘤及抗病毒等作用[12-13]，2个溶出量同时增加成分的药理作用确有重合(抗炎、抗肿瘤等)。如后续的肿瘤动物实验等能证实：厚朴酚+绿原酸的药效活性≈半夏-厚朴药对配伍4∶3的药效活性>半夏-厚朴配伍其他比例的药效活性，那么即可证明半夏-厚朴间配伍及二者4∶3的配伍比例存在合理性。

注：A.厚朴酚；B.和厚朴酚；C.4-甲氧基和厚朴酚；D.obovatol。图4 厚朴中4个厚朴酚结构类似物

但药对的方法多样、研究角度也很多，是否可以从不同配伍比例有效成分溶出量的变化角度开展预测分析，后续需要MSn、核磁共振等分析手段进一步辨析，同时也还需要药理、药效学实验加以证实。