白热斯丸质量标准研究△

姜萌，李治建，张雨欣，霍仕霞*，斯拉甫 艾白，闫明*，张兰兰

1.新疆医科大学 药学院，新疆 乌鲁木齐 830011；2.新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所，新疆 乌鲁木齐 830049；3.新疆维吾尔自治区药物研究所，新疆 乌鲁木齐 830002

民族医药学在长期的发展过程中用民族药治疗白癜风积累了丰富的实践经验[1]。白热斯丸是由驱虫斑鸠菊、玫瑰花瓣、干姜、荜茇、盒果藤、蒺藜六味中药采用传统制药工艺和现代制药技术相结合生产的口服固体药丸。该制剂具有驱寒止痛、化瘀消肿、杀虫去斑的功效，能有效地激活酪氨酸酶的活性、促进黑色素的形成、增加皮肤的光敏作用，有改善病灶部位皮肤的微循环环境和补充微量元素的功能[2-4]，该制剂现主要用于白癜风的治疗。为保证白热斯丸的安全、稳定，对其质量标准项下的鉴别、检查、含量测定内容进行研究，并初步建立白热斯丸的质量标准。

1 材料

1.1 仪器

日本岛津LC-20AT高效液相色谱仪，二极管阵列检测器(DAD)；SQP电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；WD-9403A型双光观察照相仪(北京沃德生物仪器公司)；WG1-070超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)；XMTD-7000电热恒温水浴锅(北京市永光明医疗仪器有限公司)；DHG-9123A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；FCB-500A型万能高速粉碎机(上海菲力博食品机械有限公司)；UPS-Ⅰ- 40L优普系列超纯水器(四川优普超纯科技有限公司)；BJ-2D智能崩解试验仪(天津创兴电子设备制造有限公司)。

1.2 试药

槲皮素对照品(批号：10081-201610，纯度：98.3%)、胡椒碱对照品(批号：110775-201405，纯度：98.9%)均由中国食品药品检定研究院提供；驱虫斑鸠菊(产地：新疆，批号：201701003)、干姜(产地：云南，批号：201610003)、荜茇(产地：广西，批号：201609003)、玫瑰花瓣(产地：新疆，批号：201610003)、盒果藤(产地：新疆，批号：201701003)均购自北京时珍堂(宜昌)药业有限公司；甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

白热斯丸样品为自制(批号分别为：20170812、20170814、20170816、20170818、20170820、20170822、20170824、20180215、20180216、20180217)。

2 方法与结果

2.1 薄层鉴别

2.1.1 槲皮素的TLC鉴别 取10批白热斯丸粉末，每份1 g，加50 mL甲醇，超声0.5 h，滤过，滤液蒸干，加水30 mL溶解，水液加HCL 5 mL，置80 ℃水浴中水解1 h，取出迅速冷却，用乙醚萃取2次每次20 mL，合并乙醚液，用水30 mL洗涤，弃去水液，乙醚液挥干，残渣加甲醇1 mL使溶解，即得供试品溶液。取槲皮素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含4 mg的溶液，即得槲皮素对照品溶液。根据处方取缺玫瑰花瓣的其他各味药材，按法制成丸剂，取丸剂适量，照供试品溶液的制备方法制成阴性样品溶液。

照薄层色谱法实验，吸取上述供试品溶液、缺玫瑰花瓣的阴性样品溶液各10 μL及对照品溶液2 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸(5∶2∶1)为展开剂，展开，取出吹干，置紫外灯(365 nm)下检视[5]。结果见图1。

注：a.槲皮素对照；b.阴性对照溶液；c～l.10批白热斯药丸样品。图1 槲皮素薄层鉴别

2.1.2胡椒碱的薄层鉴别 取10批白热斯丸粉末，每份1 g，加5 mL无水乙醇，超声0.5 h，滤过，取滤液作为供试品溶液。另取胡椒碱对照品适量，精密称定，加无水乙醇制成每1 mL含4 mg的溶液，作为胡椒碱对照品溶液。根据处方取缺荜茇的其他各味药材，按制备工艺制成丸剂，照供试品溶液的制备方法制成阴性样品溶液。

照薄层色谱法实验，吸取白热斯丸供试品溶液、缺荜茇丸剂的阴性样品溶液各10 μL及胡椒碱对照品溶液2 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸(5∶4.5∶0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯(365 nm)下检视[6]。结果见图2。

注a.胡椒碱对照；b.阴性对照溶液；c～l.10批白热斯药丸样品。图2 胡椒碱薄层鉴别

2.2 水分检查

将丸剂粉碎，过60目药筛，取供试品2～5 g，平铺至扁形称量瓶中，扁形称量瓶事先干燥至恒质量，厚度不超过5 mm，精密称定，打开瓶盖干燥5 h，干燥温度105 ℃，盖好瓶盖，移置干燥器中，放冷0.5 h，精密称定，继续105 ℃干燥1 h，放冷后称质量，至连续两次称质量的差异不超过5 mg为止。根据减失的质量，计算供试品中含水量(%)[12]。结果显示，10批白热斯丸中含水量分别为8.49、8.58、8.48、8.59、8.47、8.46、8.40、8.40、8.59、8.51，均未超过9.0%，白热斯丸含水量符合标准。

2.3 含量测定

2.3.1 槲皮素含量测定

2.3.1.1 色谱条件 色谱柱：Shimadzu VP-ODS(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相：甲醇-0.2%磷酸水(56∶44)，流速：1 mL min-1，进样量：10 μL，检测波长：367 nm，柱温：30 ℃。

2.3.1.2 对照品溶液的配制 取适量槲皮素对照品，精密称定，置棕量瓶，加甲醇制成每1 mL含2 mg槲皮素的溶液，即对照品储备液。精密吸取0.1 mL对照品储备液，置10 mL棕量瓶，用甲醇定容至刻度线，即得质量浓度为20 μg mL-1的对照品溶液。

2.3.1.3 供试品溶液的制备 取白热斯丸粉末，约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶，加20 mL甲醇、50%盐酸5 mL，80 ℃水浴水解50 min，取出，迅速冷却，转移至50 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度线，摇匀并滤过，续滤液即供试品溶液。

2.3.1.4 阴性对照品溶液的制备 取处方缺玫瑰花的其他各味药材，按制备工艺制成丸剂，取丸剂适量，照2.3.1.3项下方法制成阴性对照品溶液。

2.3.1.5 专属性 精密吸取对照品溶液20 μL、供试品溶液20 μL、阴性样品溶液20 μL，照2.3.1.1项下色谱条件测定。结果显示，阴性样品溶液在槲皮素相应的保留时间未出现色谱峰，表明在该色谱条件下槲皮素和胡椒碱的吸收良好，基线无干扰，白热斯丸中其他成分对槲皮素测定无干扰。

注：A.阴性样品溶液；B.槲皮素对照品；C.供试品溶液。图3 槲皮素HPLC图

2.3.1.6 线性关系考察 精密量取对照品储备液适量，逐级稀释制成200、100、50、25、12.5、6.25 μg mL-1对照品系列液。按照2.3.1.1项下色谱条件进行测定，以峰面积(Y)为纵坐标，进样溶液浓度(X)为横坐标，进行线性回归，得回归方程Y=51 536X-112 070，r=0.999 5，说明槲皮素质量浓度在6.25～200 μg mL-1线性关系良好。

2.3.1.7 精密度试验 取同一份样品溶液，按照2.3.1.1项色谱条件进行测定，连续进样6次，结果槲皮素的峰面积RSD为0.13%，表示方法精密度良好[7]。

2.3.1.8 重复性试验 取同一批号(20170812)的白热斯丸各6份，按2.3.1.3项下方法制备白热斯供试品溶液，对槲皮素进行含量测定，峰面积RSD为0.05%，表示方法重复性良好[8-9]。

2.3.1.9 稳定性试验 取同一白热斯丸(20170812)供试品溶液，分别于1、2、4、6、8、12、24 h分别按照2.3.1.1项色谱条件进样，测定槲皮素的峰面积。计算得槲皮素RSD为0.13%(n=7)，说明白热斯丸供试品溶液在24 h内稳定性良好[10-11]。

2.3.1.10 加样回收率 分别称取约0.25 g已知含量的白热斯药丸(20170812)粉末9 份，精密称定，再分别按照高、中、低浓度，精密加入一定量槲皮素对照品，混合均匀，按2.3.1.3项下方法处理后，按2.3.1.1项色谱条件进行测定，计算加样回收率，白热斯丸中槲皮素平均加样回收率为95.7%，RSD=2.77%，符合《中华人民共和国药典》规定。

2.3.1.11 样品含量测定 精密称取10批白热斯药丸，照2.3.1.3项下方法制备，并照2.3.1.1项色谱条件进行测定，同时计算槲皮素含量，结果见表1。

表1 白热斯丸中槲皮素含量测定结果 mg g-1

2.3.2胡椒碱含量测定

2.3.2.1 色谱条件 色谱柱：Shimadzu VP-ODS(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相∶甲醇-水(77∶23)，流速：1 mL min-1，检测波长：343 nm，柱温：30 ℃，进样量：10 μL。

2.3.2.2 对照品溶液的配制 取适量胡椒碱对照品，精密称定，置棕量瓶，加甲醇制成每1 mL含2 mg的溶液，即对照品储备液。精密吸取0.1 mL对照品储备液，置10 mL棕量瓶中，用甲醇定容至刻度线，即得质量浓度为20 μg mL-1的对照品溶液。

2.3.2.3 供试品溶液的制备 取0.1 g白热斯丸粉末，精密称定，置棕量瓶，加25 mL甲醇，称定质量，超声0.5 h，取出放冷，再称定质量，用甲醇补足减失质量。摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.3.2.4 阴性对照品溶液的制备 根据处方取缺荜茇的其他各味药材，按法制丸剂，取丸剂适量，照2.3.2.3项下方法制成阴性对照品溶液。

2.3.2.5 专属性 精密吸取对照品溶液20 μL、供试品溶液20 μL、阴性样品溶液20 μL，照2.3.2.1项色谱条件测定。结果显示，阴性样品溶液在胡椒碱相应的保留时间未出现色谱峰，表明在该色谱条件下胡椒碱的吸收良好，基线无干扰，白热斯丸中其他成分对胡椒碱测定无干扰。

注：A.阴性样品溶液；B.胡椒碱对照品；C.供试品溶液。图4 胡椒碱HPLC图

2.3.2.6 线性关系考察 精密量取对照品储备液适量，逐级稀释制成200、100、50、25、12.5、6.25 μg mL-1对照品系列液。按照2.3.2.1项色谱条件进行高效液相色谱法测定，以峰面积(Y)对进样浓度(X)进行线性回归，得回归方程Y=78 378X-30 138，r=0.999 9，表明胡椒碱质量浓度在6.25～200 μg mL-1线性关系良好。

2.3.2.7 精密度试验 取同一份样品溶液，按照2.3.2.1项色谱条件进行测定，连续进样6次，结果胡椒碱的平均质量分数为5.212 mg g-1，RSD为0.000 4%，表示方法精密度良好。

2.3.2.8 重复性试验 取同一批号(20170812)的白热斯丸6份，按2.3.2.3项下方法制备白热斯供试品溶液，对胡椒碱进行含量测定，胡椒碱峰面积RSD为0.12%，表示方法重复性良好。

2.3.2.9 稳定性试验 取同一白热斯丸(20170812)供试品溶液，于1、2、4、6、8、12、24 h分别按照2.3.2.1项色谱条件进样，测定胡椒碱的峰面积。计算得胡椒碱RSD为0.000 9%(n=7)，说明白热斯丸供试品溶液在24 h内较稳定。

2.3.2.10 加样回收率 分别称取约0.05 g已知含量的白热斯(20170812)药丸粉末9份，精密称定，再分别按照高、中、低浓度精密加入一定量胡椒碱对照品，混合均匀，按2.3.2.3项下方法处理后，按2.3.2.1项色谱条件进行测定，计算加样回收率，结果白热斯丸中胡椒碱平均加样回收率为104.8%，RSD=4.05%，符合要求。

2.3.2.11样品含量测定 精密称取10批白热斯药丸，照2.3.2.3项下方法制备，并照2.3.2.1项色谱条件进行测定，同时计算胡椒碱含量，结果见表2。

表2 白热斯丸中胡椒碱含量测定结果 mg g-1

2.4 溶散时限

参照《中华人民共和国药典》四部[12]丸剂项下，取白热斯丸供试品6丸，选择适当孔径筛网的吊篮(丸剂直径在3.5 mm以上的用孔径约2.0 mm的筛网)，照崩解时限检查法(《中华人民共和国药典》2015年版四部通则092)片剂项下的方法，加挡板进行检查，要求浓缩丸应在2 h内全部溶散。结果10批白热斯丸的溶散时限均符合规定。

3 讨论

为了有效控制白热斯丸的质量，对处方中的药材进行薄层鉴别，并采用高效液相色谱法对其中的有效成分进行定量测定。同时参照《中华人民共和国药典》四部通则项下丸剂标准，进行了水分及溶散时限考察，结果表示，白热斯丸符合《中华人民共和国药典》项下规定，所建立的质量控制方法适用于白热斯丸的质量标准研究。

薄层色谱鉴别方法研究中，课题组前期从样品制备、展开剂组成及比例的选择、点样量、不同品牌薄层板、展开环境(如温度和湿度)等方面，对处方中的六味药材的薄层色谱条件进行了考察和优化。结果玫瑰花瓣和荜茇薄层结果显示，药材、对照药材及白热斯丸在相同位置显示相同斑点，且阴性无干扰，可作为薄层鉴别项，列入质量标准，而处方中的其他药材因无对照药材或阴性有干扰，不列入。

含量测定中，本研究前期对白热斯丸中槲皮素含量测定方法进行了系统考察，分别考察了提取方式、提取溶剂、水解时间、水解温度、加盐酸体积和盐酸浓度，结果以加入甲醇后直接加入5 mL 50%盐酸，80 ℃水浴水解50 min为最佳，并最终建立高效液相色谱法测定白热斯丸中槲皮素的含量。白热斯丸中胡椒碱含量测定分别考察了提取溶剂、超声提取时间和超声功率，结果以加入甲醇、50%超声功率下超声30 min为佳，最后进行系统的方法学考察，建立了高效液相色谱法测定白热斯丸中胡椒碱的含量。

白热斯丸为传统的民族药复方制剂，主要用于治疗白癜风，在新疆的各大中医医院使用广泛，临床效果确切，但尚未有系统的质量标准研究，对该产品的质量控制影响较大，本研究按照丸剂要求，对白热斯丸质量进行系统研究，从薄层鉴别、含量测定、水分、溶散时限对自制的10批白热斯丸进行质量控制研究，最终建立的方法适用性较强，可作为白热斯丸的质量标准，为该产品的质量控制提供了参考。