代谢综合征合并心肌梗死大鼠模型的建立及氧化应激相关机制的探讨

张毅，任梦萌，方涛，邸研博，崔晓旭，刘勇，贺晶，国欣涛，田凤石△

代谢综合征（metabolic syndrome，MS）是以中心性肥胖、动脉粥样硬化、血脂异常、高血压、高血糖或糖调节受损等多种症状聚集于同一个体的临床症候群［1］。心肌梗死（MI）作为冠心病死亡的主要原因，具有较高的致死率［2］。MS各组分作为冠心病的危险因素，可增加MI等缺血事件的发生风险，且MS合并MI较单纯MI患者的预后更差，MS患者并发心血管疾病的死亡率是非MS患者的2～3倍［3］。目前，国内对有关MS合并MI模型的建立及其心肌损伤机制相关报道较少。本研究旨在建立一种符合临床实际、效果理想的MS合并MI模型，并分析MS合并心肌梗死后心肌组织氧化应激水平及左室功能的变化，以期为临床研究MS合并MI后左室功能损伤的病理生理机制及防治提供必要的动物实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 4周龄无特定病原体（SPF）级雄性OLETF（otsuka long-evans tokushima fatty，为自发性2型糖尿病鼠种）大鼠18只（MS组），同品系、同周龄的正常非糖尿病雄性 LETO（long-evans tokushima otsuka）大鼠18只（对照组），体质量170～185 g，由日本大冢制药株式会社德岛研究所提供，于中国医学科学院放射医学研究所屏障环境内饲养，24 h内自由饮食水。

1.2 MS大鼠模型制备 以标准饲料适应性饲养2周后，对照组LETO大鼠饲以普通饲料，MS组OLETF大鼠饲以高脂饲料。每周记录大鼠体质量，绘制其生长曲线；每周取大鼠尾静脉血，利用拜安康血糖仪（拜耳公司）测定空腹血糖（大鼠饥饿16 h后）及餐后血糖水平；每周行口服葡萄糖耐量试验［4］（oral glucose tolerance test，OGTT），分别于0、30、60、90及120 min测定尾静脉血糖值。根据OLETF大鼠团队制定标准［5］：OGTT血糖峰值＞16.7 mmol/L和糖负荷2 h后血糖＞11.1 mmol/L，二者同时具备诊断为2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM），达到其中一项为糖耐量减低（impaired glucose tolerance，IGT）。每2周内眦静脉取血，分离血清，全自动生化分析仪检测总胆固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）水平；应用ALC-NIBP型无创血压测量仪（上海奥尔科特生物科技有限公司）测定收缩压和舒张压。MS模型成功建立标准［6］为:在IGT的基础上，MS组大鼠尤其是24周时体质量、TG、TC、血压升高明显高于对照组，差异有统计学意义。待MS组大鼠饲养至24周成模后，进行下一步分组及相关实验。

1.3 MS合并MI大鼠模型制备 对Gao等［7］心脏冠状动脉左前降支结扎模型制作方法进行改良，整个操作过程控制在2 min内完成，尽可能减少对大鼠的创伤，具体操作方法：大鼠以10%水合氯醛麻醉后，Sham组及MS-sham组只开胸穿线不结扎左前降支；MI组及MS-MI组左侧胸部备皮，严格无菌消毒，铺无菌洞巾，备高压灭菌手术器械。大鼠采取右侧卧位，将其舌拉伸至口外，防止麻醉后舌后坠。沿左4～5肋间距胸骨0.3 cm处行横切口，钝性剥离暴露心脏，局部利多卡因浸润并轻柔挤出于切口外。以5-0 mersilk针带线于左心耳下缘绕前降支穿过并结扎，深度约1 mm、宽度1.5 mm。术毕予保温措施待其麻醉苏醒，并行青霉素肌内注射预防感染。MI模型成功建立标准为心电图示Ⅰ、Ⅱ导联持续ST段抬高。

1.4 超声心动图 大鼠在心肌梗死模型制备后24 h行超声心动图检查。在麻醉状态下使用VEVO2100型超高分辨率小动物超声实时分子影像系统（Visual Sonics公司）测量左心室舒张末期内径（left ventricular end-diastolic dimension，LVEDD）、左心室收缩末期内径（left ventricular end-systolic dimension，LVESD）、左心室短轴缩短率（left ventricular fraction shortening，LVFS）、左心室射血分数（left ventricular ejection fractions，LVEF）。

1.5 标本采集 各组大鼠在心肌梗死模型制备后72 h，每组取4只经10%水合氯醛麻醉后，取股动脉血5 mL，4℃、3 000 r/min离心15 min取上清液置于-80℃冰箱保存待测；取左心室心肌组织300 mg，预冷的PBS漂洗2遍后均分为三等分迅速置于-80℃冰箱保存待测。

1.6 心肌组织氧化应激指标的检测 取大鼠左心室心肌组织100 mg，冰上匀浆，于4℃、12 000 r/min离心15 min取上清液，根据试剂盒说明书采用分光光度法检测心肌组织中氧化应激指标谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSHPx）、总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）。所有试剂盒均购自南京建成生物工程公司。

1.7 Western blotting检测心肌组织中硫氧还原蛋白（TRX）、硫氧还原蛋白相互作用蛋白（TXNIP）表达 取上述大鼠左心室心肌组织100 mg，冰上匀浆，于4℃、12 000 r/min离心15 min取上清液，BCA法检测总蛋白浓度，免疫印迹法检测TRX和TXNIP表达情况。应用Image Lab进行图像分析，测定灰度值。目的条带与对应的β-actin条带总灰度的比值作为半定量结果，进行统计学分析。所用的一抗和二抗均购自于英国Abcam公司，稀释比为一抗1∶2 000，二抗1∶5 000。

1.8 Real-time PCR检测心肌组织中TRX、TXNIP mRNA表达 上述大鼠左心室心肌组织50 mg，利用RNeasymini kit（美国Qiagen公司）提取心肌总RNA，采用Takara逆转录试剂盒合成cDNA并置于-20℃保存备用。引物由北京奥科生物技术公司设计并合成，见表1。根据QuantiFast SYBR Green RT-PCR Master（one step）试剂盒说明书进行 Real-time PCR，反应参数：95℃预变性 5 min；95℃变性 10 s，59～62℃退火 30 s，72℃延长30 s，40个循环；72℃延伸10 min。以β-actin作为内参。

Tab.1 The information of RT-PCR primers表1RT-PCR引物信息

1.9 统计学方法 采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，采用Graphpad Prism 6.0软件系统分析、作图；符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，2组间比较采用t检验，不同因素对检测指标的影响采用析因设计的方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

Fig.1 Body weight and OGTT test in control rats and MS rats图1 2组大鼠体质量及OGTT试验

2.1 MS大鼠模型相关指标 MS组及对照组大鼠体质量自第6周起至24周逐渐升高，前者增长速度明显快于后者，从高脂饲养后的第6周（鼠龄12周）至18周（鼠龄24周），MS组大鼠的体质量均高于对照组，见图1A。OGTT试验显示，MS组大鼠各时间点血糖值均高于对照组，无论是MS组还是对照组，血糖的峰值均未达到16.7 mmol/L，但是MS组的120 min血糖高于11.1 mmol/L，提示MS组大鼠发生了IGT，而对照组大鼠未发生IGT（图1B）。在大鼠24周龄时，MS组的空腹血糖、餐后血糖、TC、TG、收缩压、舒张压均明显高于对照组（P＜0.05），提示MS大鼠造模成功，可以进行心肌梗死造模，见表2。

Tab.2 Comparison of blood glucose,blood lipid and blood pressure between control rats and MS rats表2 2组大鼠血糖、血脂及血压指标比较 （n=18，±s）

Tab.2 Comparison of blood glucose,blood lipid and blood pressure between control rats and MS rats表2 2组大鼠血糖、血脂及血压指标比较 （n=18，±s）

＊P＜0.05；1 mmHg=0.133 kPa

组别对照组MS组t空腹血糖（mmol/L）4.07±0.21 5.75±0.35 17.627＊餐后血糖（mmol/L）5.88±0.63 11.34±1.01 19.522＊TC（mmol/L）2.07±0.15 3.25±0.30 14.793＊组别对照组MS组t TG（mmol/L）0.50±0.13 1.34±0.18 16.102＊收缩压（mmHg）93.28±8.61 125.85±12.26 9.224＊舒张压（mmHg）65.45±10.18 85.16±7.57 6.952＊

2.2 MS合并MI模型大鼠左室功能评价 心梗造模的手术存活率为88.89%（16/18）。析因分析结果显示，MS和MI对大鼠的LVEDD、LVESD、LVFS、LVEF均有影响（P＜0.05），两者对大鼠的LVEDD、LVFS、LVEF有交互效应（P＜0.05），见表3。

Tab.3 Left ventricular function evaluation after operation in each group of rats表3 各组大鼠术后左室功能评价 （±s）

Tab.3 Left ventricular function evaluation after operation in each group of rats表3 各组大鼠术后左室功能评价 （±s）

＊P＜0.05

组别Sham组MS-Sham组MI组MS-MI组析因分析n9988 LVEDD（mm）7.30±0.37 7.56±0.49 9.25±0.30 10.15±0.47 LVESD（mm）5.18±0.46 5.49±0.32 7.50±0.39 8.14±0.29 LVFS（%）32.63±1.53 31.83±0.80 19.25±1.26 15.72±0.16 LVEF 0.61±0.02 0.58±0.03 0.37±0.05 0.30±0.01 FMS FMI FMS*MI 16.806＊252.853＊4.970＊13.898＊375.491＊1.594 33.865＊1 547.796＊13.592＊22.062＊587.914＊5.185＊

2.3 心肌组织氧化应激指标的变化 析因分析结果显示，MS和MI对大鼠心肌组织的GSH-Px、TAOC、MPO、MDA均有影响（P＜0.05），两者交互作用对大鼠心肌组织的T-AOC和MDA有影响（P＜0.05），见表4。

2.4 心肌组织中TRX、TXNIP蛋白和mRNA表达变化 析因分析结果显示，MS和MI对TRX和TXNIP蛋白和mRNA水平均有影响（P＜0.05），两者仅对TXNIP mRNA水平有交互作用（P＜0.05）；见图2，表5。

Tab.4 Comparison of oxidative stress related indexes of myocardial tissue between four groups of rats表4 大鼠造模后心肌组织氧化应激相关指标比较 （±s）

Tab.4 Comparison of oxidative stress related indexes of myocardial tissue between four groups of rats表4 大鼠造模后心肌组织氧化应激相关指标比较 （±s）

＊P＜0.05

组别Sham组MS-Sham组MI组MS-MI组析因分析n 9988 GSH-Px（mg/L）231.86±10.50 213.95±11.66 184.25±8.61 170.94±8.29 T-AOC（U/kg）5.64±0.43 4.95±0.08 4.15±1.35 2.31±0.39 MPO（U/g）0.78±0.07 0.97±0.09 1.37±0.32 1.73±0.17 MDA（µmol/g）0.58±0.07 0.82±0.08 1.28±0.07 1.77±0.09 FMS FMI FMS*MI 20.857＊175.669＊0.453 26.751＊71.141＊5.441＊17.698＊111.183＊1.721 198.142＊980.192＊21.768＊

Fig.2 The protein expression levels of TRX and TXNIP in myocardial tissue of each rat group图2 各组大鼠术后心肌组织TRX、TXNIP蛋白表达变化

Tab.5 The protein and mRNA expression levels of TRX and TXNIP in myocardial tissue of each rat group表5 各组大鼠术后心肌组织TRX、TXNIP蛋白及mRNA的表达变化

3 讨论

建立稳定、合理、可复制性强的MS动物模型对于MS基础研究至关重要，本研究选取兼顾基因遗传型及环境诱导型特点的OLETF大鼠作为动物模型，其多食、易患肥胖、高胰岛素血症、高脂血症和高血糖症，可较好地模拟人类MS自然病程［8］。本研究中，24周龄MS大鼠OGTT试验中各个时间点的血糖均显著高于对照组，提示MS组大鼠出现胰岛素抵抗现象且伴有IGT，此外24周龄MS组大鼠体质量、空腹血糖、餐后血糖、TC、TG水平较对照组LETO大鼠显著增高并伴有明显高血压，以上现象符合文献报道的MS特征［6］，表明大鼠MS造模成功，可进行下一步心肌梗死造模实验。本研究心肌梗死造模采用结扎大鼠冠状动脉左前降支的方式，具有周期短、精确定位梗死部位，操作便捷等优点；且手术过程未使用小动物呼吸机、未插管，简化操作程序［7］，整个过程于3 min内完成，同时也增加了实验操作难度，对实验者提出了较高技术要求，必须反复训练，但对于肥胖MS大鼠，此种微创技术避免了气管插管、切断肋骨等二次创伤，提高术后存活率。

MS作为多种心血管危险因素的集合体，其组分如肥胖、高血压、血脂代谢紊乱、糖耐量异常等均为心血管疾病的危险因素，与非MS患者比较，MS罹患心血管疾病、急性心肌梗死等事件的危险程度显著增加，作为MS最严重的合并症之一MI住院患者MS患病率高达51.7%［9］。临床及动物水平的研究均显示，MS的危险因素如胰岛素抵抗、血脂异常、炎症因子、氧化应激等在心肌梗死及梗死后进一步心功能损害中发挥重要作用［10］。超声心动图是检测心肌梗死直观而可靠的方法［11］，在本研究中，大鼠心肌梗死术后经超声心动图检测左室功能，析因分析结果显示，MS和MI对大鼠的LVEDD、LVESD、LVFS、LVEF均有影响，两者交互作用会进一步影响大鼠的左室功能（主要为LVEDD、LVFS、LVEF），提示本研究MI造模成功且MS可以加重心肌梗死造成的左室功能降低。

氧化应激是指机体在受到缺血、缺氧等不利因素时，体内生成过量、高浓度的活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）及活性氮 自由基（reactive ntrogen species，RNS），并由其引起的细胞凋亡、组织损伤的病理生理反应，被认为是包括心血管疾病、MS、心肌缺血及心肌梗死等一系列疾病的危险因素［12］。生理情况下，为避免体内聚集高浓度ROS，自由基清除系统发挥着重要作用。作为抗氧化系统重要组成部分，GSH-Px可迅速清除机体内过量的ROS［13］，T-AOC是体内非酶性和酶性抗氧化物的总和，其为各抗氧化物之间协同保护作用的体现，可反映机体抗氧化酶的功能状态，可间接反映机体所受氧化应激的损伤程度，其含量与细胞抗氧化能力呈正相关，与机体脂质过氧化程度呈负相关［14］。MDA是氧自由基作用于膜上多不饱和脂肪酸发生过氧化反应的终末代谢产物，可直接破坏细胞膜，可间接反映细胞的损伤程度［15］。氧化酶MPO的活性可在一定程度上反映机体受到氧化应激损伤的状况［16］。本课题组前期研究发现，高脂饮食诱导的MS大鼠，其心肌组织已出现损害［4］。本研究通过检测各组大鼠心肌组织中的GSH-Px、T-AOC、MPO、MDA水平，析因分析结果显示，MS和MI对大鼠心肌组织的GSH-Px、T-AOC、MPO、MDA均有影响，两者交互作用会进一步影响大鼠的心肌组织的氧化应激水平（主要为T-AOC和MDA），提示MS可加重心肌梗死造成的心肌组织氧化应激水平增高。

TRX作为体内的一种重要的二硫键还原酶，是细胞内具有氧化还原活性的可溶性酸性小分子蛋白，能够清除ROS、还原蛋白质以恢复机体生理功能。除此之外，TRX还具有抗凋亡、调控基因表达和抗炎等作用。硫氧还原蛋白系统是机体一种对抗氧化应激，维持氧化还原反应的平衡系统。TXNIP为TRX功能和表达的负性调节因子，可下调TRX表达，进而加剧氧化应激［17］。免疫印迹和Real-time PCR实验的析因分析结果显示，MS和MI对TRX和TXNIP蛋白和mRNA水平均有影响，两者交互作用仅对TXNIP mRNA水平有影响，两者的共同作用可以分别影响TRX和TXNIP的蛋白及mRNA水平，并且两者单独作用都会引起心肌组织中TRX和TXNIP表达水平的变化，因此不能忽视MS本身对心肌组织硫氧还原系统的影响。蛋白转录及翻译机制复杂，在心肌组织中，MS是慢性改变，MI是急性改变，两者作用于TRX和TXNIP表达的具体机制仍需进一步探讨。此外，心肌氧化应激水平受多种途径调控，MS在引起心肌组织硫氧还原系统破坏的同时可能通过调节其他信号通路发挥作用，并在心肌梗死的过程中发挥促进氧化应激水平、破坏左室功能的作用。

综上所述，在发生了MI后，MS会进一步加剧心肌梗死造成的左室功能下降及心肌组织氧化应激水平增高。分析其原因可能部分与破坏硫氧还原系统的稳定有关，氧化应激水平的增高进一步提高心肌损伤并影响左室功能，另外，MS对TRX和TXNIP的蛋白和mRNA水平均有影响，提示MS可能从转录水平影响了TRX和TXNIP的表达，但MS调控硫氧还原系统的机制及MS是否会通过其他信号通路在心肌梗死时发挥作用还需进一步探讨。通过高脂饮食喂养OLETF大鼠并利用结扎冠状动脉左前降支的方法制作MS合并心肌梗死模型的方法简便、实用性强，符合MS合并心肌梗死临床发病实际情况。TRX系统稳定性被破坏可能是MS加重心肌组织氧化应激水平及左室功能下降的内源性机制之一。本课题组将进一步深入研究MS合并心肌梗死后可能影响心肌功能的信号通路，为临床治疗MS合并心肌梗死提供新的方向。