穿龙薯蓣种子质量分级标准研究

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(辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 116600)

穿龙薯蓣(DioscoreanipponicaMakino)为薯蓣科多年生草本植物，分布于我国东北、华北、山东、河南、安徽、浙江北部、江西(庐山)、陕西(秦岭以北)、甘肃、宁夏、青海南部、四川西北部[1]。以干燥根茎入药，习称穿山龙，味甘、苦，性温[2]，具有祛风除湿，舒筋通络，活血止痛等作用。现代药理研究发现，穿山龙具有明显的抗炎作用，有较好的开发前景[3]。随着穿山龙药材需求量的不断增加，其药材商品的需求量也随之增多，不同区域产地间药材商品质量差异较大等问题也随之凸显。原因之一是穿龙薯蓣种子商品质量差异较大。然而关于穿龙薯蓣种子质量等级的划分标准十分不清晰，很难对市售种子的质量进行有效的控制和评价，造成种子质量良莠不齐，严重影响药材的规范化生产成效。因此，本研究在对不同产地穿龙薯蓣种子全面收集的基础上，根据《农作物种子检验规程》(GB/T 3543-1995)[4]开展穿龙薯蓣种子质量分级标准研究，以期为规范和制定穿龙薯蓣种子质量标准提供依据，实现市售种子的规范化，从源头控制穿龙薯蓣药材的质量。

1 材料与仪器

1.1 材 料

穿龙薯蓣种子于2016—2017年收集，共27个批次样品，分别来源于黑龙江省、吉林省、辽宁省、内蒙古自治区、甘肃省、青海省、宁夏回族自治区、陕西省、山西省、山东省、河北省、河南省、安徽省、浙江省、江西省、湖南省、四川省、广西壮族自治区。其中，辽宁共8份样品，分别收集于辽宁省清原县、辽宁省清原县英额门镇丁家街村、辽宁省清原县英额门镇椽子沟村、辽宁省清原县大孤家镇、辽宁省新宾县大四平乡、辽宁省阜新市、辽宁省本溪市、辽宁省鞍山市；吉林省3份样品，分别收集于吉林省柳河县三源浦镇、吉林省梅河口龙山、吉林省梅河县山城镇。经辽宁中医药大学尹海波教授鉴定为薯蓣科植物穿龙薯蓣的干燥成熟种子，各种子批产地来源编号见表1。

1.2 仪 器

LRH-150-GIS人工气候箱(韶关市泰宏医疗器械有限公司)，DNP-9162型电热恒温培养箱(上海精宏实验设备有限公司)，电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)，JD 60-4电子天平(沈阳龙腾电子有限公司)，SLY-C微电脑自动数粒仪(杭州绿博仪器有限公司)。

2 方 法

试验参照《农作物种子检验规程》(GB/T 3543-1995)[4]标准执行。

2.1 扦 样

种子批的最大重量为10 000 kg，送检样品最少为50 g，净度分析试样最少为5 g(不少于2 500粒)。

表1 种子来源信息

2.2 真实性鉴定

采用种子外观形态法，随机选取100粒种子，4组重复，利用显微镜、游标卡尺等仪器进行外观形态观察，并记录观察结果。

2.3 净度测定

每一批次种子分别选取50 g，重复3次，供试种子去掉杂质和废种子后，剩余洁净种子的重量占样品总重量的百分率即为种子净度。

2.4 百粒重测定

利用自动数粒仪从“2.3”项下的净种子中随机数取100粒，8个重复，分别称重，计算8个重复的平均质量、标准差及变异系数。变异系数不超过4.0%视为测定值有效。

2.5 含水量测定

采用高恒温烘干法[5]，称取各产地穿龙薯蓣种子样品5 g于烘为恒重的称量瓶中，130 ℃恒温烘干3 h，计算种子含水量。

2.6 发芽率测定

将各产地穿龙薯蓣净种子用清水冲洗掉泥沙，浸泡于75%乙醇中消毒40 min，后用大量清水冲净乙醇，再用纯净水润洗3遍备用。将各产地种子置于直径150 mm，铺有1层纱布1层滤纸的培养皿中 ，于20 ℃人工气候培养箱中培养，每天统计发芽率，每产地设置3次重复，每重复100粒种子。

2.7 生活力测定

采用四唑染色法进行。取各产地100粒新鲜种子，沿种脊将种子切成两半，露出胚乳。滴入浓度为0.6%的TTC溶液浸没种子，置于45 ℃恒温培养箱中避光染色4 h[5]，3个重复。

3 实验结果

3.1 外观形态结果

穿龙薯蓣种子呈椭圆形，长比宽约大2倍，四周有不等的薄膜状翅。种仁椭圆形，呈深棕色，腹侧凹入处下缘具有点状脐，由种脐向一侧面伸出一线状种脊。胚白色，胚芽明显，具子叶一枚。

3.2 各项指标测定结果

对收集的27个产地的穿龙薯蓣种子样品进行净度、含水量、百粒重、发芽率、生活力等指标的测定，结果见表2。

结果显示，山东、安徽、广西、四川等4个地区的种子净度较低(在85%以下)，其中广西种子净度明显低于其他产区(低于65%)；吉林省柳河县三源浦镇、梅河县山城镇、辽宁省清原县、英额门镇丁家街村、内蒙古、陕西、山西的种子净度较高，均达到95%以上；辽宁省与吉林省的种子为一年生，其百粒重在0.89～1.40 g之间，其他省份为二年生种子，其百粒重在160.28～210.08 g之间；含水量在7.34%～11.63%之间，其中辽宁省阜新市、本溪市、鞍山市种子含水量较低，均在8.00%以下，辽宁省清原县大孤家镇、新宾县大四平乡、内蒙古、甘肃、青海南部、宁夏、山西、山东、河北、河南、浙江北部、江西(庐山)、四川、广西的种子含水量较高，均在10%以上。不同产地的穿龙薯蓣种子发芽率、生活力差异较大，发芽率在14%～88%之间，生活力在15%～94%之间。

4 数据分析处理

4.1 聚类分析

应用SPSS 20.0软件对表2中测定的5项指标进行系统聚类分析，聚类方法采用最远距离法，区间选择平方欧氏距离，将27个产地的穿龙薯蓣种子在阈值10处分为两级，结果如图1。由图1可知，辽宁不同产地的8批种子与吉林不同产区的3批种子为一类，其余各省及自治区为一类。

表2 不同产地穿龙薯蓣种子各指标测定结果

结合系统聚类分析的结果，初步将27个穿龙薯蓣种子进行了质量等级划分，并将各等级不同指标的置信区间进行统计，见表3。

表3 穿龙薯蓣种子测定指标等级划分区间

4.1.1 含水量等级划分区间的确定

从聚类分析结果可以看出，一级种子和二级种子含水量的取值范围存在重叠，一级种子含水量为7.34%～10.42%，二级种子含水量为9.31%～11.63%，不能通过含水量将一级种子和二级种子区分开来。为获得更为准确的含水量等级划分标准必须进行进一步数学处理，参照黄河[6]等的处理方法，具体如下：

1) 含水量等级界限的确定：按下列公式计算含水量界限。

M=(T1M小+T2M大)/2=(9.31+10.42)/2=9.865(%)，T1M小为一级种子含水量界限下限，T2M大为二级种子含水量界限上限。

因此，从含水量考虑，穿龙薯蓣种子一级和二级划分界限为9.865%。

2) 含水量划分等级的可行性分析：以含水量9.865%为等级划分界限，将27个产地穿龙薯蓣种子样品划分为一级和二级，获得一级种子15个，二级种子12个。对27个产地种子含水量数据进行正态性检验，符合正态分布，因此采用独立样本t检验法对一级种子和二级种子含水量进行统计分析，结果可知p=0.00<0.01，即以含水量9.865%为等级划分界限时，两级种子间存在极显著性差异，故此划分依据合理。

4.1.2 净度等级划分区间的确定

采用含水量等级区间划分的相同方法，计算确定穿龙薯蓣种子一级品和二级品净度的划分界限为92.59%。以净度92.59%为等级划分界限，将27个产地种子样品划分为一级品和二级品，获得一级品13个，二级品14个。对净度数据进行正态性检验，不符合正态分布，因此采用秩和检验法对一级种子和二级种子含水量进行统计分析，结果可知p=0.00<0.01，即以净度92.59%为等级划分界限时，两级种子间存在极显著差异，故此划分依据合理。

4.1.3 百粒重等级划分区间的确定

根据聚类分析结果，一级品与二级品种子的百粒重分级区间为：一级品0.89～1.40 g，二级品160.28～210.08 g。对百粒重数据进行正态性检验，不符合正态分布，因此采用秩和检验法对一级种子和二级种子百粒重进行统计分析，结果可知p=0.00<0.01，即以一级品百粒重0.89～1.40 g，二级品百粒重160.28～210.08 g为等级划分界限时，两级种子间存在极显著差异，故此划分依据合理。

4.1.4 发芽率等级划分区间的确定

采用含水量等级区间划分的相同方法，计算确定穿龙薯蓣种子一级品和二级品发芽率的划分界限为63%。将27个产地种子样品划分为一级品和二级品，获得一级品10个，二级品17个。对发芽率数据进行正态性检验，符合正态分布，因此采用独立样本t检验法对一级种子和二级种子发芽率进行统计分析，结果可知p=0.00<0.01，即以发芽率63%为等级划分界限时，两级种子间存在极显著差异，故此划分依据合理。

图1 穿龙薯蓣种子系统聚类分析树状图

表4 穿龙薯蓣种子连续性变量测定指标等级划分取值范围

4.1.5 生活力等级划分区间的确定

采用含水量等级区间划分的相同方法，计算确定穿龙薯蓣种子一级品和二级品生活力的划分界限为82%。将27个产地种子样品划分为一级品和二级品，获得一级品10个，二级品17个。对生活力数据进行正态性检验，符合正态分布，因此采用独立样本t检验法对一级种子和二级种子生活力进行统计分析，结果可知p=0.00<0.05，即以生活力82%为等级划分界限时，两级种子间存在显著差异，故此划分依据合理。

4.2 穿龙薯蓣种子连续性变量测定结果等级划分范围的确定

根据上述分析结果，为提高标准的可执行性，对各测定指标数据取值范围进行调整和修正，结果见表4。

按表4中各测定指标修正后的取值范围，同4.1项下分析方法进行独立样本t检验和秩和检验(服从正态分布的资料采用独立样本t检验，不服从正态分布的资料采用秩和检验)，所得穿龙薯蓣种子一级品和二级品之间均有显著差异，p值均小于0.05，即划分依据合理。故而根据上述数据处理结果，初步制定了穿龙薯蓣种子质量分级标准，见表5。将27个不同产地的穿龙薯蓣种子分为2个等级，分级方法采用最低定级原则，即任何一项指标不符合定级标准均不能作为相应等级的合格种子。分级结果为一级种子有6个，二级种子有21个。

表5 穿龙薯蓣种子质量分级标准结果

5 讨 论

5.1在计算每一级种子置信区间范围时，部分指标的置信区间发生了重叠。以含水量为例，为解决置信区间重叠的问题，参照黄河[6]的方法，以均数加减一个标准差确定一级种子和二级种子的正态分布范围，结果如下：

一级种子和二级种子正态分布仍存在重叠，所以需要对数据进行进一步处理。取一级品指标的界限下限与二级品指标的界限上限中点为新的界限值，对其进行可行性分析，进而得出新的界限值具有可行性。得出各指标等级划分取值范围后，根据可执行性与实际应用价值对取值范围进行调整和修正，修正后的结果即为穿龙薯蓣种子质量分级标准结果。

5.2经过进一步数学处理后的结果与原聚类分析的结果有所不同，聚类分析结果中一级种子有11个，二级种子16个，而经过进一步界限值确定后结果为一级种子6个，二级种子21个。这是由于此分类方法很苛刻，提高了分类的要求。

5.3种子是个体植株的雏形，药材质量的优劣、产量的高低与中药材种子的质量息息相关。种子商品处于整个中医药现代化产业链的上游，其质量优劣的客观评价直接影响后续产业链的进行[7-10]。目前关于穿龙薯蓣种子的质量等级划分非常不清晰，很难对市售种子的质量进行有效的控制和评价，造成种子质量良莠不齐，严重影响规范化生产成效[11-13]。因此，本研究在对不同产地穿龙薯蓣种子全面收集的基础上对其质量指标系统测定和质量分级标准进行了研究，初步制定了穿龙薯蓣种子质量分级方法，为规范和制定穿龙薯蓣种子质量标准提供依据，以期实现市售种子的规范化，从源头控制穿龙薯蓣药材的质量。

各类文献规范数据选项表

注：“√”为必备项，“0”为任选项，“*”为有则加项，“-”为不要求项。