不同耐盐性菜用大豆与大豆根瘤菌的共生匹配性研究

代重阳，孙继鑫，王 聪

（内蒙古民族大学 农学院，内蒙古 通辽 028000）

根瘤菌是一类广泛生活在土壤中的革兰氏阴性细菌，根瘤菌根据其生长速度可以分为两个类群：快生型根瘤菌与慢生型根瘤菌，能侵染豆科植物根部诱导固氮根瘤形成，为固氮酶提供适宜的微环境，从而使大量的分子态N2被固定转化为铵，为豆科植物提供氮素营养[1]。经根瘤菌固定的氮素能提高土壤肥力，并供在茬和下茬作物利用[2]。因此，合理并且充分的利用共生固氮体系可以减少氮肥施用量，从而减少化肥生产对环境带来的压力以及化肥过量使用对土壤结构的破坏[3-4]。同一根瘤菌能与多种豆科植物实现共生，具有“广谱共生”现象[5]。但不同根瘤菌与同品种大豆的共生固氮能力也存在着明显差异[6-7]。此外，根瘤菌与豆科植物共生固氮还会受环境条件的强烈影响。逆境胁迫会影响豆科植物根瘤的形成、发育和根瘤的固氮效率[8-9]。李梅等[10]研究NaCl 胁迫对苜蓿共生结瘤的影响发现，盐浓度≥100 mmol/L时，随着浓度的升高，根瘤数量不断减少，根瘤不断变小，同时固氮区细胞数量也相应减少。ABDELWAHAB[11]研究表明，高浓度盐胁迫会更大程度地影响根瘤菌数量和质量，较低浓度的盐胁迫影响更多的是根瘤固氮酶活性、豆血红蛋白含量和类菌体的蛋白质含量，同时，豆科植物-根瘤菌良好的共生关系也有助于提高植物的耐盐性。祁娟等[12]研究发现，在非接菌情况下，随着NaCl浓度的提高，NaCl对苜蓿的生长抑制作用增大，而接菌以后，不同菌株均通过其固氮作用、根瘤菌与苜蓿共生对其生长及生理应答特性的改变来提高苜蓿抗盐胁迫的能力。因此，筛选豆科植物-根瘤菌良好共生体系对生产中实现“减肥”及提高豆科植物抗盐胁迫能力均具有重要意义。

菜用大豆，又称毛豆，是在鼓粒盛期至初熟期生育期采青食用的大豆总称。菜用大豆除含有丰富的植物蛋白质、氨基酸、碳水化合物、矿物质等营养成分外还含有丰富的VC和VB1等营养品质[12-13]。近年来，随着人们生活水平的提高，菜用大豆的种植面积逐年增加。然而，随着设施栽培面积的大幅度提高及不合理的水肥管理，土壤盐渍化和次生盐渍化呈现继续扩大的趋势。盐胁迫已成为限制包括菜用大豆在内的蔬菜设施栽培的主要逆境因子。

为此，本研究以菜用大豆耐盐品种绿领八号和盐敏感品种日本青以及10个大豆根瘤菌为试验材料，对其进行共生匹配性研究，以期筛选出结瘤固氮能力较强的菜用大豆-根瘤菌共生体系，为豆科植物抗盐栽培及实现“减肥”提供参考，为进一步研究豆科植物结瘤固氮及抗盐机制提供优良材料。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株品种 NGR234、HH103、B16、N18、USDA110、USDA122、CB1809（购自黑龙江省农科院微生物研究所）、ACCC15067、AS1.826、AS1.909（购自北纳生物技术有限公司）共10株。其中，快生型根瘤菌为NGR234、HH103、B16、N18、ACCC15067；慢生型根瘤菌为USDA110、USDA122、CB1809、AS1.826、AS1.909。

1.1.2 菜用大豆品种 选用耐盐品种绿领八号和盐敏感品种日本青（购自中科种业）。

1.2 试验方法

1.2.1 根瘤菌的培养 菌种活化：在菌种保藏管里，挑一环根瘤菌，三线平板法划在固体YMA 培养基上，倒置放入29℃菌种培养箱中，黑暗处理（快生型菌种72 h，慢生型菌种96 h），直至长出单菌落。

菌种纯化：挑一环活化过的单菌落根瘤菌，三线平板法划在固体YMA 培养基上，倒置放入29℃菌种培养箱中，黑暗处理（快生型菌种48 h，慢生型菌种72 h），直至长出单菌落。

菌悬液制备：挑一环纯化过的单菌落根瘤菌，接种到液体YMA 培养基中，29℃、180 r/min 振荡黑暗培养（快生型菌种48 h，慢生型菌种72 h）。

菌悬液浓度测定：用分光光度计测定菌悬液的浓度在600 nm 下OD值≈1.0。

1.2.2 菜用大豆种子消毒 挑选种皮无破损、饱满度相近的种子，用95 %乙醇冲洗30 s，配置1∶5次氯酸钠无菌水溶液浸泡2 min，然后用无菌水反复冲洗7次，进行种子消毒。

1.2.3 双瓶法栽培 在塑料瓶底部小孔塞入10 cm长的纱布条，放置于灌有无氮营养液的玻璃瓶上，经纱布引流保持上层塑料瓶中的湿润度。将消毒后的菜用大豆种子直播于上层的塑料瓶中，以蛭石为基质，每瓶定植1株，每个菌种种植7 瓶，3次重复。将双层瓶随机摆放于人工气候箱内。设置白天光照16 h，光照强度为90～100 μmol/（m2·s），温度为20～23℃；夜间黑暗8 h，温度为16～18℃。待菜用大豆两片真叶展开后进行接种，每株苗接种1 mL菌液，从接种日起生长至30d后进行测定。

1.3 指标测定

结瘤数量：分别统计各个组植株结瘤数量并记录。根瘤鲜重：将统计好的根瘤用吸水纸吸干表面水分，进行称重记录鲜重。固氮酶活性：取新鲜根瘤用乙炔还原法测定根瘤的固氮酶活性。地上部生物量：将冲洗干净的植株吸干，置于75℃烘箱中烘干后称其地上部干重。植株全氮：将烘干后的全株粉碎，取粉末用凯氏定氮法测定植株含氮量。

1.4 综合值计算

综合值：为某一供试菌种各共生固氮指标的Z/Z′值之和。其中，Z为根瘤菌-菜用大豆组合的某一共生固氮指标值，Z′为所有供试根瘤菌与该菜用大豆品种组合的同一共生固氮指标值之和。

1.5 数据分析

利用SPSS与Excel软件进行数据分析处理。

2 结果与分析

2.1 菜用大豆-根瘤菌共生组合的地上部生物量

由表1可知，耐盐品种绿领八号-USDA122组合的地上部生物量与接种USDA110 无显著差异，但显著高于其他共生组合；绿领八号-NGR234组合的地上部生物量最低，较绿领八号-USDA122组合降低16%。盐敏感品种日本青-HH103组合的地上部生物量与接种USDA110 无显著差异，但显著高于其他共生组合；接种B16、CB1809、AS1.909、AS1.826的地上部生物量均较低。表明不同菜用大豆-根瘤菌组合对菜用大豆的地上部生长有显著影响。

2.2 菜用大豆-根瘤菌的共生固氮指标

由表2可知，10种根瘤菌都能与耐盐品种绿领八号共生结瘤，并且都具有固氮酶活性，说明无论慢生型根瘤菌还是快生型根瘤菌与绿领八号的匹配组合下，都可以产生有效根瘤。其中接种USDA122后单株平均根瘤数和根瘤固氮酶活性最高，分别为35.89个/株和19.87 μmolC2H4/（mg·min），均显著高于其他共生组合。而接种CB1809的根瘤数最少，仅为6.33个/株；接种NGR234的固氮酶活性最低，仅为9.12 μmolC2H4/（mg·min），均显著低于其他组合。接种USDA122的根瘤鲜重与接种N18、USDA110、AS1.826 无显著差异，但显著高于其他组合。接种USDA122的植株全氮量除与接种HH103后差异不显著外，均显著高于其他共生组合。

10种根瘤菌都能与日本青有效结瘤。接种HH103的根瘤数、根瘤鲜重、根瘤固氮酶活性及植株全氮量均最高，分别为40.14个/株、0.38g/株、16.20 μmolC2H4/（mg·min）、23.16g/kg，且显著高于其他共生组合。接种USDA110的根瘤数、根瘤固氮酶活性及植株全氮量与接种N18 无显著差异，但显著高于除HH103 外的其他7个组合（表2）。上述结果表明，根瘤菌不同菌种与菜用大豆的共生固氮能力存在显著差异。

表2 不同菜用大豆-根瘤菌共生组合的结瘤固氮指标

2.3 菜用大豆-根瘤菌共生组合结瘤固氮综合评价指标的建立

由上述试验结果可看出，不同大豆根瘤菌与同一品种菜用大豆的结瘤固氮能力存在显著差异，但同一菌种与同一品种菜用大豆的不同共生固氮指标表现不一致，如CB1809与绿领八号共生组合的结瘤数最少，但其根瘤固氮酶活性却较高；而N18与日本青共生后的结瘤数、根瘤固氮酶活性及植株全氮量均较高，但根瘤鲜重却较低（表2）。为了更准确地评价各菌种与两菜用大豆品种的结瘤固氮能力，假定各结瘤固氮指标对综合评价指标的影响相同，用Z/Z′表示各指标对结瘤固氮的相对影响能力，各菌种与菜用大豆结瘤固氮能力的综合评价指标为该菌种各结瘤固氮指标的Z/Z′值之和，称为综合值，综合值越大，则该组合的结瘤固氮能力越强。

由表3可知，与耐盐品种绿领八号共生的10种根瘤菌中，USDA122的综合值最大，为0.77；B16和CB1809的综合值最小，均为0.29。各菌种与盐敏感品种日本青共生后，HH103的综合值最大，为0.62；CB1809的综合值最小，为0.30。相关性分析发现，绿领八号和日本青与各菌种共生后对应的综合值与其地上部生物量分别呈显著（r=0.645 4）和极显著（r=0.842 4）正相关，表明综合值能够准确反映各菜用大豆-根瘤菌共生体系的结瘤固氮能力。因此，根据综合值的大小，各菌种与耐盐品种绿领八号共生固氮能力由强到弱依次是：USDA122＞AS1.826＞HH103、USDA110 ＞N18 ＞AS1.909 ＞ACCC15067、NGR234＞B16、CB1809，与盐敏感品种日本青共生固氮能力由强到弱依次是：HH103＞USDA110＞N18＞USDA122、NGR234 ＞AS1.909 ＞B16 ＞ACCC15067、AS1.8＞CB1809。

表3 不同菜用大豆-根瘤菌共生组合的综合值

3 讨论与结论

豆科植物与根瘤菌共生固氮获取氮素相比施用氮肥更经济有效和无污染，尤其是在可持续发展的理念下，发展菌肥显得尤为重要，大豆根瘤菌与菜用大豆的匹配性是提高固氮效率的关键，是菌肥应用的前提条件[14-16]。伍惠等[17]通过大豆根瘤菌与不同地区27个大豆主栽品种共生匹配性研究发现，不同大豆根瘤菌之间结瘤固氮能力存在极显著差异。马中雨等[5]的研究认为，快生型根瘤菌表现出比慢生型根瘤菌更严格的大豆品种匹配性。冀照君等[18]的研究则发现中华根瘤菌属（Sinorhizobium）及慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）的大豆根瘤菌都能与鲁黄一号有效共生，但中华根瘤菌属较慢生根瘤菌属菌株的共生性能要好。

本研究发现，不同大豆根瘤菌之间的结瘤固氮能力存在显著差异；慢生根瘤菌USDA122与耐盐品种绿领八号、快生根瘤菌HH103与盐敏感品种日本青均有极好的共生匹配性（表3），这与冀照君等[18]的研究结果不尽相同。上述研究结果说明大豆根瘤菌与大豆品种共生匹配的复杂性及共生匹配性研究的必要性。

植株生物量是植物体生长发育状况的综合体现，它与植物体的生理活动密切相关。与根瘤菌共生固氮作为豆科植物重要的生理过程，其结瘤固氮能力的强弱也必然与植物生长及干物质积累密切相关。根瘤数、根瘤鲜重、根瘤固氮酶活性及植株全氮量作为衡量豆科植物与根瘤菌共生固氮能力的重要指标，它们的综合表现更能准确反映豆科植物与根瘤菌的结瘤固氮能力。本研究中引入的综合值与菜用大豆地上部生物量呈显著或极显著正相关就充分证明了这一点，同时也表明以综合值作为菜用大豆与根瘤菌共生匹配性综合评价指标是可行的。