微小RNA调控干扰素-α在系统性红斑狼疮发病机制中的作用

夏 源，李向培

中国科学技术大学附属第一医院风湿免疫科， 合肥 230001

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种多系统受累的以多种自身抗体产生和免疫耐受丢失为特征的自身免疫性疾病，其中Ⅰ型干扰素刺激基因[type Ⅰ interferon (IFN)-stimulated genes，ISGs]表达增加导致的循环Ⅰ型IFN水平升高对SLE疾病的发生和进展具有重要作用[1]。SLE患者血清IFN-α表达增加与疾病严重性、复发及组织受累密切相关(尤其是皮肤，肾脏和中枢神经系统)。近年研究显示微小RNA(microRNA，miRNA)可通过抑制信号通路活性或增加信号传导调控SLE Ⅰ型IFN通路的多个方面，包括模式识别受体(pattern recognition receptor,PRR)通路IFN调节基因的表达、编码IFN细胞表面受体基因的转录等。同时Ⅰ型IFN信号通路也可直接诱导或抑制miRNA表达，两者相互作用共同参与SLE免疫应答的调节[2]。

1 微小RNA结构与功能

miRNA是一种参与基因表达转录后调节的内源性非编码RNA家族。这些短小且高度保守的非编码RNA由宿主基因转录后经核糖核酸酶Ⅲ Drosha处理形成前体转录物，随后在胞浆Dicer作用下形成成熟的miRNA双链并与RNA沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)结合而成。新生成的成熟miRNA可立即与其目标mRNA 3′非翻译区互补性结合，以降低mRNA稳定性并抑制翻译，负性调节靶蛋白表达。miRNA可从细胞分化增殖到凋亡的每个环节对细胞活性进行调节，其中一些miRNA表达具有组织特异性和发展阶段特异性，可在机体应对各种环境刺激时发挥调节和维持免疫系统稳定的作用。miRNA失调与SLE多种病理过程相关，包括B和T淋巴细胞的异常分化与凋亡，调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)抑制功能的丧失等，研究显示miRNA表达的改变与狼疮发病机制的各个方面广泛相关，因而成为研究SLE发病机制的新窗口。

2 干扰素-α与微小RNA

Ⅰ型INF主要包括IFN-α和IFN-β，可由多种细胞产生，如浆细胞样树突状细胞(plasmacytoid dendritic cells,pDCs)、单核细胞、淋巴细胞和中性粒细胞。IFN-α受体(IFN-α receptor，IFNAR)是一种膜二聚体受体，由IFNAR-1和IFNAR- 2链组成。Ⅰ型IFN与IFNAR1结合后主要通过Janus激酶(Janus kinases,JAK)和转录激活因子(signal transducers and activators of transcription，STAT)通路进行信号传导，引起胞浆JAK1和络氨酸激酶2及后续的STAT1和STAT2磷酸化。活化的STAT1和STAT2复合物与Toll样受体9(Toll-like receptor 9,TLR9)结合转移至细胞核继而与IFN调节成分结合，从而激活数百种靶ISGs的转录[3]。PRR信号通路如TLR的激活则可诱导pDCs产生Ⅰ型IFN。PRR信号通路主要由髓样分化因子88、TAK1结合蛋白、白细胞介素- 1受体相关激酶和IκB激酶ε(IκB kinase ε,IKKε)组成，调节转录因子NF-κB 和干扰素调节因子(interferon regulatory factor,IRF)的表达，前者可诱导促炎症细胞因子基因转录，后者可调节Ⅰ型IFN基因转录[4]。

固有免疫途径中miRNA的异常表达参与Ⅰ型IFN通路的调节。miR- 466i可在转录阶段抑制巨噬细胞和树突状细胞产生IFN-α[5]。IRF8作为miR- 618的靶基因在pDCs发育和活化中发挥重要作用。miR- 618过表达可抑制CD34+细胞分化成pDCs，且可提高pDCs分泌Ⅰ型IFN的能力[6]。miR- 21通过抑制其靶基因PTEN表达促进pDCs 产生IFN-α，miR- 21敲除可显著减少小鼠IFN-α表达并导致抗病毒免疫应答异常[7]。SLE患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)中miR- 126表达增加，且与IFN-α mRNA水平呈负相关，提示miR- 126可能通过抑制IFN-α表达参与SLE的发病与进展[8]。miR- 146a作为固有免疫的负性调节因子在SLE患者中表达减少，且该miRNA可通过与TLR信号通路中的关键蛋白基因(IRF5和STAT1)结合抑制SLE患者Ⅰ型IFN的异常产生[9]。除了通过PRR信号通路影响IFN的合成途径，miRNA也可直接调节Ⅰ型IFN下游信号通路的各个阶段。miR- 29a可减少小鼠胸腺上皮细胞IFNAR- 1表达，在受体阶段减少胸腺细胞的Ⅰ型IFN应答[10]。细胞因子信号抑制因子1(suppressor of cytokine signaling 1,SOCS1)作为Ⅰ型IFN信号的负性调节因子，接受多种miRNA的调节，如miR- 19a、miR- 122、miR- 146a和miR- 155[2]。此外，Ⅰ型IFN也可反馈调节miRNA的形成。SLE患者血管内皮细胞中miR- 155表达较健康对照显著增加，研究发现给予人血管内皮细胞IFN-α干预可显著增加细胞内miR- 155的表达，提示INF-α对miR- 155具有一定诱导作用[11]。

3 干扰素-α与系统性红斑狼疮

大量研究证实IFN失调，尤其是IFN-α活性和/或信号异常是SLE免疫紊乱的关键因素。SLE患者血清IFN-α水平增加，且与疾病活动性和严重性相关。转录基因组分析发现，SLE患者PBMCs中IFN-α诱导基因表达上调并与SLE疾病活动指数呈正相关[12]。几乎所有的儿童SLE患者和50%的成人SLE患者具有该特征[13]。抗IFN单克隆抗体sifalimumab[14]和rontalizumab[15]及抗IFNAR单克隆抗体Anifrolumab[16]在最近完成的Ⅱ期临床试验中表现出的显著疗效也验证了Ⅰ型IFN在SLE发病机制中的关键作用。

SLE 患者IFN-α主要是由INF“免疫复合物”(immune complexes，ICs)诱导pDCs产生，这些ICs主要由自身抗体和核酸结合蛋白组成，pDCs表面Fc-γIIa受体介导ICs中的核酸成分与TLR7或TLR9结合促进IFN-α分泌[1]。该通路信号异常引起的多种生物事件可能参与SLE自身免疫和炎症的启动和维持,如上调TNF家族的B细胞活化因子和肿瘤坏死因子配体超家族成员13表达促进B细胞存活，增加Ⅰ型和Ⅱ型主要组织相容性复合物，以及CD86和CD80表达，诱导pDCs活化产生多种促炎症细胞因子。CD4+T/CD8+T细胞和B细胞也可诱导Ⅰ型IFN导致炎症的恶化和持续。此外，过度表达的 Ⅰ 型IFN和ISGs可延长自身反应性T淋巴细胞寿命，刺激CD4+T和CD8+T记忆细胞发育并抑制Treg功能导致自身免疫耐受的破坏[17]。Th17细胞也可在Ⅰ型IFN诱导下分化增殖进而导致SLE发生炎症反应[18]。动物实验也证实敲除IFNAR可防止小鼠发生狼疮样改变，给予NZB/W狼疮鼠IFN-α干预则可加速其疾病进展。

4 微小RNA调控干扰素-α在系统性红斑狼疮发病机制中的作用

miRNA与IFN-α间的异常调节发生在多种自身免疫性疾病机制中。SLE患者和模型鼠免疫细胞中miRNA与IFN-α异常表达之间关联的研究一直是近年研究热点。利用基因芯片技术发现SLE患者PBMCs中有29种miRNA表达减少，其中部分miRNA参与SLE关键通路的调节，如TLR信号通路、Ⅰ型IFN通路和ISGs的表达[19]，多篇文献报道并总结了相关信号通路异常[20- 21]。

4.1 miR- 146a

研究发现SLE患者PBMCs中miR- 146a表达较健康对照组显著降低，并与疾病活动性呈负相关[22]。SLE患者miR- 146a表达减少可引起其靶基因IRAK1、TRAF6、STAT1和IRF5表达增加，导致IFN-α表达水平和信号传导增强[23- 25]，促进T细胞增殖、自身反应性T细胞分化及B细胞自身抗体产生。小鼠缺失miR- 146a表现出严重的自身免疫表现，如高滴度自身抗体的产生、脾大和淋巴结肿大[26]。SLE患者白细胞miR- 146a表达的减少与疾病本身过度活化的炎症反应密切相关。IFN诱导基因单核细胞诱导蛋白1(monocyte chemotactic protein-induced protein 1,MCPIP- 1)可通过干扰Dicer功能，抑制miRNA前体形成阻断miRNA成熟。研究发现，Ⅰ型IFN可通过减少miR- 146a前体产生抑制miR- 146a成熟，SLE患者白细胞中MCPIP- 1表达增加，且与miR- 146a表达呈负相关[27]，提示Ⅰ型IFN可通过上调MCPIP- 1表达抑制miR- 146a成熟，参与SLE炎症持续和炎症基因表达增加。Dominguez-Gutierrez 等[28]对被诊断为SLE贫血患者的52次随访(部分患者随访2次)血标本进行分析发现，SLE贫血患者IFN评分、STAT1、 miR- 146a、CCL2和CXCL10表达较非贫血SLE患者均显著增高；此外，去除疾病活动性、狼疮肾炎和性别差异，SLE贫血患者的STAT1和miR- 146a仍显著高于非贫血患者，提示miR- 146a和STAT1升高可能在SLE贫血机制中发挥重要作用。

4.2 miR- 302d 和miR- 17- 5p

miR- 302d(miR- 302d- 3p)是一种雌激素相关miRNA，SLE患者单核细胞中高度活化的雌激素信号与低表达miR- 302d密切相关。IRF9作为miR- 302d的靶基因，在SLE患者单核细胞中表达增加。进一步研究发现，减少单核细胞miR-302d表达可增加Ⅰ型IFN信号通路活性和ISGs表达，提示miR- 302d是SLE患者Ⅰ型IFN基因异常表达的关键调节因子，miR- 302d异常导致IRF9表达增加并参与破坏SLE患者IFN系统稳定，从表观遗传学角度进一步对SLE的性别差异作出解释[29]。

最近研究发现转录因子E2F1可通过调控IRF3的表达参与IFN系统的调节。miR- 17- 5p是E2F1上游调节因子之一，可破坏E2F1/c-Myc正反馈环路防止E2F1和c-Myc的过表达。SLE患者PBMCs中miR- 17- 5p表达减少，且转染miR- 17- 5p可抑制E2F1和c-Myc表达，提示E2F1/c-Myc/miR- 17- 5p系统异常参与SLE Ⅰ型IFN水平异常增高机制[30]。

4.3 miR- 451a和miR- 126

miR- 451a与SLE疾病进展密切相关。Faslpr/lpr狼疮模型鼠脾脏和淋巴结中miR- 451a表达均增加。敲除狼疮模型鼠miR- 451a可明显减少自身抗体和炎症因子产生，缓解脾大症状，减轻肾脏损害。HEK293细胞双荧光素酶基因检测发现，相比阴性对照miRNA(WT+ Neg)，miR- 451a类似物与WT IRF8 3′-UTR融合可显著抑制荧光素酶的活性，证实IRF8为miR- 451a的靶基因；且狼疮模型鼠脾和淋巴结中miR- 451a高表达与IRF8低表达相一致，提示miR- 451a可能通过调节IRF8参与SLE的发病机制[31]。

SLE患者PBMCs中miR- 126表达减少，Ⅰ型IFN诱导基因ISG56 和血清IFN-α水平降低。转染miR- 126类似物可减少SLE患者PBMCs中ISG56和IFN-α表达，而给予miR- 126抑制因子干预可增加SLE患者PBMCs中ISG56和IFN-α表达，提示miR- 126低表达可促进SLE患者IFN信号通路激活[32]。

4.4 miR- 155和miR- 130b

miR- 155在SLE患者PBMCs中表达较健康对照显著减少，并与IFN-α mRNA表达呈负相关。SLE是血管内皮受损的一个危险因素，IFN-α可通过促进内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)的转录抑制和mRNA失稳参与人脐静脉内皮细胞的损害。抑制人内皮细胞miR- 155表达可减轻IFN-α对NOS 3的抑制，缓解SLE患者血管粥样斑块的形成，为SLE患者动脉粥样硬化的形成提供了新见解[11]。Kaga等[33]也发现SLE患者PBMCs中miR- 155、miR- 17和miR- 181b较健康对照显著减少，且与IFN-α mRNA水平呈负相关。萤光素酶基因分析显示IFN-α是miR- 181b的靶基因。

SLE患者和模型鼠的肾脏组织中miR- 130b表达减少，且狼疮肾炎患者中miR- 130b低表达与其自身的异常IFN应答呈负相关。通过miR- 130b刺激剂增加IFN-α加速的狼疮肾炎(lupus nephritis, LN)模型鼠miR- 130b表达，可缓解小鼠LN的进展，阻止肾小球疾病的发生。体外试验也证实miR- 130b可通过调节其靶基因IRF- 1表达抑制肾脏系膜细胞内Ⅰ型IFN下游信号通路，提示miR- 130b在LN病程进展中发挥重要作用，可能为LN的治疗提供新方法[34]。

4.5 let- 7e- 5p、 miR- 98- 5p 和 miR- 145a- 5p

B细胞IFN-α信号活性的增加参与了SLE的发病机制。Hou等[35]研究发现，小鼠17β雌二醇可通过下调let- 7e- 5p、 miR- 98- 5p 和 miR- 145a- 5p表达增加IFN-α信号活性。IKKε作为这3种miRNA的靶基因,可促进IFN-α信号活化。健康女性和雌鼠B细胞中let- 7e- 5p, miR- 98- 5p 和 miR- 145a- 5p表达显著低于等龄健康男性和雄鼠，而IKKε表达水平显著偏高。这些结果提示17β-雌二醇可通过下调B细胞let- 7e- 5p、miR- 98- 5p 和 miR- 145a- 5p表达增加IKKε表达促进B细胞IFN-α信号活化，进一步解释了SLE疾病的性别差异。

5 小结与展望

多种抗IFN-α单克隆抗体临床试验结果显示，抑制该因子表达可有效缓解SLE病情并改善预后。SLE患者循环ISGs和IFN-α过表达与miRNA的关联提示miRNA也可能成为治疗SLE的新靶点。增加或阻断调控其靶基因miRNA表达的方法称之为agomirs 或 antagomirs[36]。由于miRNA可对基因表达进行调节，因而可能具有治疗范围广、安全性强的优点。

SLE患者miR- 146a表达减少并与IFN-α表达成负相关。正常小鼠敲除miR- 146a后可表现出严重的自身免疫症状，如自身抗体水平增加、脾肿大和淋巴结疾病。利用MS2 VLP-based 传输系统恢复狼疮模型小鼠miR- 146a表达可有效减少小鼠自身抗体的产生，并延缓疾病进程[37]，提示增加miR- 146a水平有可能成为治疗SLE的有效方法。敲除狼疮模型鼠miR- 451a可明显减少自身抗体和炎症因子产生，缓解脾大症状，减轻肾脏损害[31]。抑制人内皮细胞miR- 155表达可减轻IFN-α对NOS3的抑制，缓解SLE患者血管粥样斑块的形成[11]。miR- 130b刺激剂可缓解小鼠狼疮肾炎的进展，阻止肾小球疾病的发生[34]。miR- 155基因敲除可显著缓解狼疮小鼠的肺损害和肾脏疾病，降低外周血自身抗体水平和CD4+CD25+FOXP3-细胞比例。此外，相比较pristane诱导型狼疮鼠，miR- 155基因敲除狼疮鼠表现出更低水平的IFN标记(MX1、IP10、IRF7、ISG15)[38]。这些研究可能为未来SLE的治疗提供新策略。

SLE疾病机制十分复杂，IFN-α作为SLE发病机制的关键因子已得到广泛认知。SLE患者和模型鼠体内多种miRNA表达异常与IFN-α信号通路异常活化密切相关，免疫干预miRNA有望成为一种新的改善SLE患者预后的治疗方法。