反式-4-羟基-L-脯氨酸发酵菌株的筛选

李春玲，丁亚莲，谢文静，牛春，张萍

(宁夏泰瑞制药股份有限公司，银川 750101)

反式-4-羟基-L-脯氨酸(trans-4-hydroxy-L-proline, Hyp)，简称羟脯氨酸，是一种稀有亚氨基酸，在医药保健、材料化工、食品营养和护肤美容等行业都具有广泛的应用[1-3]。值得关注的是，Hyp是胶原蛋白的组成成分，也是肝和胆囊的构成成分, 具有多种生理功能和生物活性，对维持动物正常生理代谢、提高体内营养物质利用效率起着重要作用[4-6]。目前，Hyp的生产方法有三种，即生物组织提取法、化学合成法和微生物合成法。生物组织提取法是利用动植物组织作为原料，通过系列化学方法回收得到Hyp[7]。目前，该方法是国内生产Hyp的主要方法，但存在生产和纯化步骤多、杂酸含量高、产率低、成本高、环境污染大、废水废渣难处理等诸多问题[5]。化学合成法多以(S)-苄氧甲基环氧乙烷为原料，通过系列化学反应，最终生成Hyp。该方法存在原材料成本高，生产过程中会使用有毒性物质等问题，实际生产已经弃用[8]。微生物合成法即微生物发酵法，是通过微生物细胞发酵表达反式-4-脯氨酸羟化酶(trans-4-proline hydroxylase)，将游离的L-脯氨酸(L(-)-proline，)转化为Hyp的生产方法。与前两种方法相比，微生物发酵法具有反应所需能耗低、专一性极强、无副产物、原材料来源广泛、不使用或很少使用有毒物质、环境污染小等优点[8-10]。

采用生物组织提取法生产Hyp的方法已经不符合我国日益严峻的环保形式，而且有限的动植物资源也严重制约了本行业的发展。化学合成法工艺复杂，成本较高，且环境污染严重。因此，采用微生物发酵法生产Hyp将成为未来发展的必然趋势。但是，国内有关Hyp的微生物发酵法研究起步较晚，仅见盛花开[11]、袁春伟[12]、刘合栋[13]等关于基因工程菌株构建、初级发酵条件优化的研究，鲜见工业化生产目的菌株筛选相关报道。鉴于此，实验以工业化生产应用为目的，对引进的8株产Hyp菌株的生长特性、发酵效率进行比较分析，以期筛选出优良菌株，为实现Hyp微生物发酵工业化生产奠定一定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 出发菌株为8株含有重组质粒的产Hyp大肠杆菌，由宁夏泰瑞制药股份有限公司技术中心引进保存。胰蛋白胨、酵母提取物购自Oxoid公司，琼脂粉购自Sigma公司，其他试剂均为国产分析纯。

活化平板(LB固体)：包含胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠，pH7.0～7.2，琼脂粉。抗性平板(LB固体)：包含胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、琼脂粉、抗性RL，pH7.0～7.2。抗性培养基(LB液体)：包含胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、琼脂粉、灭菌冷却后添加抗性RL，pH7.0～7.2。非抗性培养基(LB液体)：包含胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、琼脂粉,pH7.0～7.2。Hyp摇瓶培养基(MCG)：包含葡萄糖、甘油、尿素、玉米浆、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、ZnSO4·7H2O、VB1、抗性RL、L-脯氨酸，pH 7.4。发酵罐(50 L)培养基：葡萄糖、甘油、尿素、玉米浆、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、ZnSO4·7H2O、VB1、抗性RL、L-脯氨酸，pH7.4。

恒温大幅振荡摇床(HQL150C，武汉科学仪器厂)、恒温培养箱(LHP160，江苏杰瑞尔电器有限公司)、分光光度计(BECKMANDU-600)、高效液相色谱系统(Waters)。

1.2 方法

1.3.1 菌种活化 将冷藏于-80 ℃冰箱的菌种取出，室温融化，接种环划线接种于活化平板上，30 ℃培养过夜，用活化后的菌种制备斜面种子，保存待用。

1.3.2 菌株重组质粒稳定性测定 参照盛花开等的方法[11]，活化后的菌种接至装30 mL抗性培养基的三角瓶(规格250 mL)中，30 ℃、220 r/min、摇床培养20 h后转接非抗性培养基，连续转接6次，取菌液梯度稀释至10-6，涂布至活化平板，然后挑单菌落接种至抗性平板，统计质粒留存率。质粒留存率=生长菌落数/点接菌落数×100%。

1.3.3 种子制备 活化后的菌种挑取单菌落，接种至装有30 mL抗性培养基的三角瓶(规格250 mL)中，30 ℃、220 r/min、摇床培养10 h。

1.3.4 菌株生长曲线测定 取种子液3.6 mL接种于装有60 mL抗性培养基的三角瓶(规格500 mL)中，间隔2 h取发酵液，连续取样12次，以ddH2O为对照，测定样液在600 nm吸光值，作生长曲线。

1.3.5 菌株全细胞酶活测定 参照刘合栋等的方法[13]，取发酵液1.5 mL，12000 r/min离心2 min；弃去上清液，回收菌体，加入500 μL酶反应缓冲液(MES 240 mmol/L、L-脯氨酸20 mmol/L、α-酮戊二酸40 mmol/L、硫酸亚铁4 mmol/L、Vc 8 mmol/L)重悬菌体细胞，混匀，30 ℃ 220 r/min、摇床培养15 min后，沸水浴2 min，终止酶反应，测定Hyp浓度，分析细胞全酶活性。定义1个单位酶活为1 min将1 nmol/L L-脯氨酸完全转化为反式-4-羟脯氨酸的酶量，单位为U。全细胞酶活是每mg干菌体的酶活，单位为U/mg。

1.3.6 Hyp浓度测定 参照盛花开等的方法[11]，取发酵时间24～48 h的发酵液，每隔4 h取样1次，利用高效液相色谱法测定Hyp浓度。液相条件：C18柱(200 mm×4.6 mm)，流动相为乙腈∶水=5∶95，流速为1.0 mL/min，柱温为室温。

2 结 果

2.1 菌株重组质粒稳定性分析 8株菌株经活化后，对其菌株重组质粒稳定性进行测定分析，结果发现编号Hyp-Y1801、Hyp-Y1805、Hyp-Y1808的菌株重组质粒的留存率均超过95%，重组质粒稳定性较好，作为出发菌株(表1)。

表1 菌株重组质粒稳定性Tab 1 Stability of recombinant plasmid in strains

2.2 菌株生长曲线分析 对Hyp-Y1801、Hyp-Y1805、Hyp-Y1808菌株的发酵生长曲线进行分析发现，三菌株均在发酵4 h时进入对数生长期，在2 h

后进入平稳期，对数期约为8 h(图1)。种子培养时间确定为10 h。

图1 菌株生长曲线分析Fig 1 Strain growth curve analysis

2.3 菌株全细胞酶活分析 取Hyp-Y1801、Hyp-Y1805、Hyp-Y1808平稳期(12 h)发酵液，对菌株全细胞酶活进行分析发现，Hyp-Y1801、Hyp-Y1805、Hyp-Y1808全细胞酶活分别为0.076、0.037、0.071 U/mg，其中Hyp-Y1801、Hyp-Y1808酶活较高。

2.4 菌株发酵效率分析 以Hyp-Y1801、Hyp-Y1808为生产菌株进行发酵小试，每隔4 h取样1次，测定发酵液中Hyp的浓度，以此确定菌株的生产效率。表2结果表明，随着时间延长Hyp的浓度逐渐升高，发酵44 h时Hyp浓度达到最高，分别为50.4 g/L、47.5 g/L。

表2 菌株发酵效率Tab 2 Fermentation efficiency of strains

3 分析与讨论

目前，国内主要依靠生物组织提取生产Hyp，该方法存在最主要的问题是产物的得率很低，仅为4%～7%，而且产生大量排放物，带来巨大的环保风险，这些问题大大限制了该技术规模化应用[6]，导致国内Hyp生产发展十分缓慢，生产规模较小，产量极其有限。但是，随着Hyp的广泛应用，市场对其需求急剧增加。微生物发酵法生产技术具有成本低、效率高等优势，采用该技术开展Hyp规模化、高效化生产，是未来发展的必然。目前，国内尚未见微生物发酵法工业化生产Hyp的报道。

Hyp生产的发酵菌株主要包括细菌、霉菌以及链霉菌等，其中对大肠杆菌(细菌)发酵菌株研究较多，应用较为成熟[8]。本研究引进了8株产Hyp大肠杆菌菌株，并对其发酵生产性能进行系统分析。引进的产Hyp大肠杆菌为基因工程菌株，菌体所含的重组质粒负责编码Hyp合成的关键酶。重组质粒的稳定性是保障Hyp发酵生产的根本。本研究发现， Hyp-Y1801、Hyp-Y1808菌株重组质粒的稳定性很好，留存率均超过了95%，可以有效保障Hyp发酵生产的顺利进行。在此基础上，本研究对菌株的生长特性、全细胞酶活和生产效率进行了分析，发现Hyp-Y1801、Hyp-Y1808发酵4 h时，进入对数生长期，在12 h后进入平稳期，对数期约为8 h，这与盛花开[11]、刘合栋[13]等的研究报道较一致。Hyp-Y1801菌株的全细胞酶活较高，且发酵效价达到了50.4 g/L，较袁春伟[12]、刘合栋[13]等报道的高18.6%，较Shibasaki等[8]报道的高22.9%，具有较好的实际生产应用潜力。有关Hyp-Y1801中试生产试验正在进行之中，菌株的优良特性在规模化生产中的实际表现还有待进一步验证。