大鼠H9c2心肌细胞有氧氧化及无氧酵解的影响因素探讨

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由于各种心脏疾病及其他基础疾病的影响，心脏心室充盈及射血能力受到损伤引起慢性充血性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)的发生和发展。CHF病程长且进行性加重，其进展具有不可逆性，发病率和死亡率逐年增加，是国内外学者研究的重点。近年来大量研究开始关注心肌细胞能量代谢调节在CHF中的作用[1]。在心力衰竭过程中，心肌细胞能量代谢与心力衰竭进展密切相关，心肌细胞能量合成可以保持心脏基本物质代谢的稳定，从而维持心脏功能并满足机体各个脏器代谢需要。由于脂肪酸和糖类的代谢失衡，造成心肌细胞内能量代谢方式的变化，从而引起心肌内部结构损伤功能障碍。因此，调节心肌细胞能量代谢方式可成为治疗心力衰竭的新方法。

在常氧条件下，心脏中>95%的三磷酸腺苷(ATP)来自线粒体的氧化磷酸化。余下的5%主要来自糖酵解，较少部分来自三羧酸循环[2]。糖酵解过程发生在细胞基质中，产生的乳酸释放H+到细胞外，本实验通过检测胞外H+释放速率(extracellular acidification rate，ECAR)了解糖酵解的活跃程度。线粒体有氧呼吸发生在线粒体内膜上，特点是消耗氧气，因此线粒体有氧呼吸越旺盛表明线粒体功能越旺盛。本实验通过检测氧气消耗速率(oxygen consumption rate，OCR)，了解线粒体有氧呼吸功能。细胞能量代谢检测系统利用检测O2压力和pH值，定量反映了无氧酵解和有氧氧化的过程。本实验拟以H9c2心肌细胞为研究对象，利用细胞能量代谢检测系统检测其无氧酵解和有氧氧化参数，为后期检测中药参附益心颗粒对缺氧心肌细胞能量代谢的研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 细胞系 大鼠H9c2心肌细胞株：中国科学院上海细胞库。

1.2 主要试剂和材料 DMEM培养基购自Gibco公司；胰蛋白酶购自Solarbio公司；胎牛血清购自BI公司；Seahorse XF培养基、Seahorse XF水化液、水化板、培养板、糖酵解压力测试实验试剂盒、线粒体有氧氧化压力测试实验试剂盒购自美国SEAHORSE公司；葡萄糖、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠购自SIGMA公司，NaOH及其他试剂为国产分析纯。

1.3 仪器 日本Olympus CK-40倒置显微镜，苏州安泰BCM-1300生物洁净工作台，美国Milli-Q超纯水仪，美国Seahorse XF24孔细胞能量代谢检测系统。

1.4 方法

1.4.1 细胞培养及传代 大鼠H9c2细胞株在含有10%胎牛血清的DMEM完全培养基、37 ℃，5%CO2细胞培养箱培养，生长至融合80%～90%时弃培养液，磷酸缓冲盐溶液(PBS)清洗1次，加入0.125%胰酶消化2 min，当细胞变圆脱落，立刻加入2 mL DMEM低糖培养液终止消化，用吸管吹散并转移至离心管，1 000 r/min离心5 min，重悬于新培养液，按1∶2进行传代，36～48 h换液1次。

1.4.2 糖酵解压力测试实验 根据糖酵解压力测试试剂盒(seahorse XF glycolysis stress test assay)操作。简述如下：细胞以孔密度0.5×104、1×104、1.5×104、2×104接种于Seahorse XF24孔板中，每孔先加入100 μL细胞悬液，待细胞贴壁后补加至250 μL生长培养基，置于37 ℃，5%CO2细胞培养箱培养，每行设置一个只加培养基的孔作为空白对照孔；同时将水化液置于水化板中，每孔1 mL，置于37 ℃，无CO2细胞培养箱培养；同时配置糖酵解培养基(含L-谷氨酰胺终浓度为10 μmol/L)，调节pH至7.4，0.22 μm滤膜过滤除菌，4 ℃冰箱保存备用。

16 h培养后，观察细胞密度，吸弃生长培养基，更换37 ℃，无CO2培养箱中预热的糖酵解培养基，根据4个Blank孔内液体剩余量估计液体损失量，吸出180 μL生长培养基，加入1 mL糖酵解培养基，再吸弃1 mL糖酵解培养基，该清洗步骤重复2次，最后加入450 μL糖酵解培养基，使最终溶液定容为500 μL。放入37 ℃，无CO2培养箱平衡1 h。此时用糖酵解培养基配置葡萄糖(glucose)、寡霉素(oligomycin)及2-脱氧葡萄糖(2-DG)，使其终浓度分别为100 μmol/L、100 μmol/L和500 μmol/L。在将寡霉素进行10倍稀释使其终浓度为10 μmol/L。

将水化好的探针取出，仰视板底观察是否有气泡，如果有，需要将较大的气泡除去。将水化板抬离液面，放下，再抬起，再放下，如此重复10次，直到看不到肉眼可见气泡为止。然后在每个水化板四周的A/B/C孔内分别加入葡萄糖56 μL、寡霉素62 μL、2-DG 69 μL，加样应匀速轻柔，防止试剂通过喷液口流出。取下水化板中间粉色的支架，将水化板放入预热开机的机器中，设置反应参数。平衡校准20 min后，托盘弹出，将弹出的透明板取出，更换细胞板，运行糖酵解压力测试实验。运行完毕后，使用wave2.3软件分析数据。

1.4.3 线粒体有氧氧化压力测试(cell mito stress test)实验 根据线粒体功能压力测试试剂盒操作。简述如下：细胞以2×104/孔密度接种于Seahorse XF24孔板中，置于37 ℃，5%CO2细胞培养箱培养，同时配置线粒体有氧氧化培养基(含L-谷氨酰胺终浓度10 μmol/L，丙酮酸钠10 μmol/L，葡萄糖10 μmol/L)，调节pH至7.4，0.22 μm滤膜过滤除菌，4 ℃冰箱保存备用。16 h培养后，观察细胞密度，吸弃生长培养基，更换37 ℃，无CO2培养箱中预热1 h至室温的线粒体有氧氧化培养基，根据4个Blank孔内液体剩余量估计液体损失量，吸出180 μL生长培养基，加入1 mL线粒体有氧氧化培养基，再吸弃1 mL线粒体有氧氧化培养基，该清洗步骤重复2次，最后加入450 μL线粒体有氧氧化培养基，使最终溶液定容为500 μL。放入37 ℃，无CO2培养箱平衡1 h。此时用线粒体有氧氧化培养基配置寡霉素、碳酰氰-4-三氟甲氧基苯胺[carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone，FCCP]、抗霉素A/鱼藤酮混合物(antimycin A&rotenone)，使其终浓度分别为100 μmol/L、100 μmol/L和500 μmol/L。再将FCCP进行一系列稀释，使其终浓度为0 μmol/L、0.125 μmol/L、0.25 μmol/L、0.5 μmol/L、1 μmol/L、2 μmol/L。

将水化好的探针取出，仰视板底观察是否有气泡，按照前述方法除去气泡。然后在每个水化板四周的A/B/C孔内分别加入寡霉素56 μL，不同浓度的FCCP 62 μL，抗霉素A/鱼藤酮混合物69 μL，加样应匀速轻柔，防止试剂通过喷液口流出。取下水化板中间粉色的支架，将水化板放入预热开机的机器中，设置反应参数。平衡校准20 min后，托盘弹出，将弹出的透明板取出，更换细胞板，运行线粒体有氧氧化压力测试实验。运行完毕后，使用wave2.3软件分析数据。

2 结 果

2.1 糖酵解压力测试实验 糖酵解过程中，糖酵解过程发生于细胞基质，代谢产物乳酸可释放H+到胞外，因此，检测微量环境中H+变化，也就是pH值的变化速率能够反映糖酵解程度。如图1A所示，第一步加入足量的葡萄糖，可以理解细胞对葡萄糖代谢的基础值。第二步加入寡霉素，实验证实寡霉素作用于线粒体氧化呼吸链中的ComplexV，它可以充分抑制有氧呼吸，阻断线粒体有氧呼吸ATP合成，细胞为了维持能量供给，会上调糖酵解功能，产生大量乳酸，可检测到最大的胞外H+释放速率。第三步加入2-脱氧葡萄糖，葡萄糖竞争性抑制剂。可以被己糖激酶磷酸化成为磷酸2-脱氧葡萄糖(2-GD-p)在细胞中累积，抑制糖酵解第一步反应，阻断葡萄糖代谢。

结果如图1B所示，每孔细胞密度0.5×104、1×104、1.5×104、2×104糖酵解的最大值随着接种密度的增加而增大。结合速率进行比较，每孔细胞密度1.5×104、2×104为比较合适的细胞密度。糖酵解、糖酵解效率、糖酵解储备值比较，1.5×104、2×104是合适浓度，详见图2。

Glucose：葡萄糖；Oligomycin：寡霉素；Glycolysis：糖酵解；Glycolytic capacity；糖酵解效率；Glycolytic Reserve:糖酵解储备

图1糖酵解压力测试曲线

图2 不同细胞密度对葡萄糖酵解能力参数比较

2.2 线粒体有氧氧化压力测试实验FCCP浓度筛选 如图3A所示，未加试剂之前OCR值反映了基础呼吸的数值。第一步加入寡霉素，实验证实寡霉素可抑制线粒体氧化呼吸链中的COMPLEX V的功能，破坏线粒体内膜两侧的电位差/抑制ATP合成。细胞培养基中加入寡霉素可观察到细胞的有氧呼吸速率下降，下降的差值即为用于ATP合成所对应的细胞氧消耗值。第二步加入不同浓度FCCP，FCCP是解偶联剂，可以恢复线粒体内膜两侧电位差，恢复电子传递链的功能，从而激发线粒体最大有氧呼吸。最大值与初始值之间的差值，即为细胞的线粒体有氧呼吸储备值。

第三步加入抗霉素A/鱼藤酮混合物，抑制线粒体有氧呼吸链复合物Ⅰ和Ⅲ的功能，全面阻遏线粒体有氧呼吸，此时细胞有氧呼吸降低至最低值。图3B所示，不同浓度(0 μmol/L、0.125 μmol/L、0.25 μmol/L、0.5 μmol/L、1 μmol/L、2 μmol/L)的FCCP刺激H9c2细胞，可引起细胞最大有氧呼吸产生不同的最大值。2 μmol/L FCCP刺激H9c2细胞可产生最大有氧呼吸值。因此，结合实验内容本实验选择2 μmol/L的FCCP刺激H9c2细胞作为后续实验的浓度。

2.3 不同浓度FCCP对线粒体有氧氧化压力测试实验中参数的影响 不同浓度(0 μmol/L、0.125 μmol/L、0.25 μmol/L、0.5 μmol/L、1 μmol/L、2 μmol/L)的FCCP刺激H9c2细胞，本实验选择能够激发出线粒体有氧呼吸最大值所对应的FCCP浓度为最适FCCP浓度，即2 μmol/L。储备呼吸功能在2 μmol/L达到最大值，有氧氧化基础值、电子漏及ATP产生指标没有显著差异。详见图4。

A：线粒体有氧氧化曲线；B：不同浓度FCCP引起线粒体呼吸功能最大值的浓度筛选。Oligomycin：寡霉素；AntimycinA&Rotenone：抗霉素A/鱼藤酮混合物

图3线粒体有氧氧化压力测试实验

Basal：有氧氧化基础值；spare respiratory capacity：储备呼吸功能；proton leak：电子漏；ATP production：ATP产生

图4线粒体压力实验OCR结果

3 讨 论

慢性心力衰竭是一种因心脏充盈和射血功能衰减而使循环血量不能满足全身代谢需求的病理生理综合征[3]，是各种器质性心脏病的终末阶段。在心力衰竭发病率中，缺血性心脏病占心力衰竭的75%左右[4]。在我国，由冠心病导致的心力衰竭是心力衰竭的常见类型。心肌重构是心力衰竭病程进展中的主要病理生理变化，而心肌能量代谢紊乱直接或间接促进了心肌重构。

van Bilsen等[5]提出了衰竭心肌的代谢重构(metabolic remodeling)概念，即心力衰竭时，心肌细胞葡萄糖、脂肪酸、乳酸、氨基酸等物质代谢紊乱引起心脏能量代谢途径改变，导致心肌结构和功能异常的现象。心力衰竭时的代谢重构可导致心肌收缩功能不全和心室重构进展，在心力衰竭的发生发展中起重要作用。因此，在心力衰竭防治领域开展心肌代谢重构的干预机制研究具有重要意义。

正常心脏维持心肌基础代谢和收缩功能的大量ATP主要由脂肪酸(FA)和葡萄糖的氧化产生，乳酸、酮体和氨基酸则是能量的次要来源[6]。大量实验证实心力衰竭心肌细胞中ATP大量减少，其浓度仅仅为正常心肌的70%以下，随着心力衰竭的进展，心肌细胞中ATP含量逐渐减少，且呈进行性加重的趋势。同时，心力衰竭心肌细胞产生能量利用梯度障碍：如ATP利用活性降低，心肌纤维摄取的ATP总量减少，呼吸链的电子传递活性减弱。线粒体是能量生成的主要场所，心肌细胞代谢所需能量主要来自线粒体。在长期缺血缺氧情况下，衰竭的心肌细胞受到大量有害物质如氢离子、乳酸、自由基等的攻击以致线粒体受损，同时心肌线粒体内部结构异常，心肌细胞呼吸链和ATP酶的活性降低，电子传递体完整性不足，以上效应逐渐积累，导致线粒体内氧化磷酸化能力减弱，以致衰竭心肌能量生成障碍，加速了心力衰竭的进程。

中医传统文献中无“心力衰竭”名称，根据临床特征本病可归属于中医“喘证”“心悸”“心痹”“心水”“水肿”等范畴，现统一命名为“心衰病”。心衰病的中医证候主要为气虚血瘀、阳虚水停，故益气温阳、活血利水为其基本治法。在我国，中医药已经成为心力衰竭综合治疗的重要手段之一，心力衰竭是心血管领域中医药防治的优势病种。近年来，诸多研究证明中医药治疗心力衰竭不仅可控制症状、改善预后，且对心肌能量代谢有一定的改善作用。如益气活血中药(心复康口服液)可增加心肌梗死后心力衰竭大鼠心肌组织中ATP含量，上调GLUT1基因的表达，有效改善心肌梗死后心力衰竭大鼠心肌能量代谢[7]。益气温阳方可以有效改善心肌梗死后心力衰竭大鼠模型心脏功能，同时提高心力衰竭大鼠心肌能量代谢产物ATP含量，减少一磷酸腺苷(AMP)、二磷酸腺苷(ADP)的含量，有效调节心肌梗死后心力衰竭大鼠心肌能量代谢紊乱[8]。参附益心颗粒可改善心力衰竭模型的心功能，减慢心率，降低血清ANP、BNP和心肌 AngⅡ水平，改善线粒体形态。提高心肌细胞膜Na+-K+-ATP酶活性，恢复心肌能量代谢[9-13]等。

细胞能量代谢检测系统利用检测O2压力和pH值，定量反映了无氧酵解和有氧氧化的过程，已经在很多细胞类型中进行能量代谢的检测[14-15]。细胞密度和FCCP浓度是影响有氧氧化和无氧酵解功能测定的主要因素，H9c2心肌细胞以8×104/孔细胞密度接种，FCCP浓度2 μmol/L刺激细胞将适合细胞线粒体功能的检测，这为后期进行参附益心颗粒对离体的心肌细胞线粒体能量代谢的保护作用提供了研究基础。