一年蓬提取物的抗菌活性

徐丽珊， 施恩琪， 王利枝， 陈佳静， 韩高琦， 邵翌雪， 胡凯婕

(浙江师范大学 化学与生命科学学院,浙江 金华 321004)

早疫病和枯萎病可分别在番茄和黄瓜的整个生长发育时期发生，是2种重要的真菌性病害[1-2].番茄早疫病能使番茄减产35%～68%[3]；黄瓜枯萎病在重病年份的发病率可达到80%～90%[4].针对番茄早疫病及黄瓜枯萎病，目前生产上普遍采用代森锰锌、多菌灵、异菌脲等化学杀菌剂来防治.但因长期大量使用，化学杀菌剂已经扩散到大气、水、土壤中，造成水源污染、土壤酸化、有机质含量减少、有益的天敌和微生物死亡等一系列严重的环境污染问题[5-6].同时，化学杀菌剂难降解、易残留，易随食物链在生物体内富集，引发了食品安全问题，危及人类健康.随着人们环保意识的增强和对食品安全的日益重视，对环境友好、安全可靠、经济高效的植物源杀菌剂受到了大众的追捧，成为了农药研发的主要途径之一.

一年蓬(E.annuus)为菊科飞蓬属植物，是原产于北美的恶性杂草，由于其强大的入侵和适应能力，该杂草已对入侵地的植物群落及环境造成了严重影响[7]，它是我国分布较广、危害较大的入侵物种之一[8]；同时，一年蓬具有化感作用，能够抑制入侵地的植物生长，并且少有天敌和病害.Velmurugan等[9]发现一年蓬花提取物对亚麻短杆菌和表皮葡萄球菌具有抑制效果.张应烙等[10]研究表明，一年蓬丙酮提取物能显著抑制杨树溃疡病菌及小麦纹枯病菌的菌丝生长和孢子萌发.实验室前期研究发现，一年蓬对黑曲霉等真菌的生长具有较好的抑制效果.实验以一年蓬为材料，研究其对番茄早疫病菌和黄瓜枯萎病菌的抑制活性，优化从一年蓬中提取抑菌活性成分的最佳工艺，筛选高抑菌活性萃取相，为进一步研制环境友好、安全可靠、经济高效的一年蓬源杀菌剂奠定基础.研究为合理利用一年蓬，提高其附加值提供一种新思路，也为分离纯化一年蓬功效单体化合物及深入探究其抑菌机理奠定基础.

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

材料:一年蓬(E.annuus)、黄瓜枯萎病菌(F.oxysporium)及番茄早疫病菌(A.solani)(浙江师范大学微生物学实验室提供)；70%可湿性粉剂(上海悦联化工有限公司)等.

仪器:微波提取仪(金华市扬天贸易有限公司)；真空干燥箱、电热鼓风干燥箱、恒温水浴锅(上海一恒科学仪器有限公司);高压蒸汽灭菌锅(日本三洋电机株式会社);超净工作台、恒温生化培养箱、旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司)等.

1.2 方 法

1.2.1 一年蓬活性成分的微波提取工艺优化

1)单因素试验

采集一年蓬洗净后，60 ℃烘箱烘干至恒重，粉碎.以水为提取溶剂，固定微波功率600 W，料液质量浓度1∶40 g/mL，时间15 min，温度分别为50,60,70,80 ℃，进行温度的单因素试验.以水为提取溶剂，料液质量浓度1∶40 g/mL，时间为15 min，温度60 ℃，微波功率分别为400,500,600,700,800 W，进行功率的单因素试验.以水为提取溶剂，温度 60 ℃，固定微波功率600 W，时间15 min，料液质量浓度分别为1∶40,1∶50,1∶60,1∶70,1∶80 g/mL，进行料液质量浓度的单因素试验.以水为提取溶剂，温度60 ℃，固定微波功率600 W，料液质量浓度1∶40 g/mL，时间分别为3,6,9,12 min，进行时间的单因素试验.

通过单因素试验得到一年蓬提取液，采用菌丝生长速率法[11]测定其抑菌活性.抑菌率可由下式计算:

2)响应面试验

根据单因素试验结果，选取3个对抑菌率影响较大的因素，借助Design-Expert 8.05b软件设计响应面[12]试验，优化一年蓬活性成分的微波提取工艺.

1.2.2 一年蓬高抑菌活性萃取相的确定

一年蓬依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇多次萃取[13]，由最佳提取工艺得到各萃取相，将萃取相于45 ℃真空干燥至含水量≤5%，并粉碎成粉末.采用菌丝生长速率法，测定各萃取相(6 mg/mL)对黄瓜枯萎病菌和番茄早疫病菌的抑制率，确定一年蓬高抑菌活性萃取相.

1.2.3 一年蓬高抑菌活性萃取相的功效验证

1)平皿抑菌活性测定

采用二倍稀释法[14]考察不同浓度一年蓬高抑菌活性萃取相和甲基硫菌灵(阳性对照)对黄瓜枯萎病菌和番茄早疫病菌的抑菌活性，确定其MIC和MBC[15]，并用SPSS软件计算一年蓬高抑菌活性萃取相及甲基硫菌灵对2种病原菌的有效抑制半数浓度(EC50).

2)离体叶片抑菌活性测定

以黄瓜幼苗和番茄幼苗为载体，以离体抑菌实验时一年蓬高抑菌活性萃取相和作为阳性对照的甲基硫菌灵的EC50值进行离体叶片实验[16-17]，以验证其活体预防效果及治疗效果.

预防效果：将生长状态相似、长势较好的幼苗相同部位叶片用刀片在叶柄处快速切下，并在规定浓度的提取物药液中浸渍3～5 s后自然晾干，叶柄用湿润的吸水脱脂棉包裹保湿，空白对照以清水处理，每组重复3次，每次处理3片叶；药液处理1 d后在叶片中脉处接种病原菌菌饼；培养6 d后，按式(1)～式(2)计算预防效果.

治疗效果：将生长状态相似、长势较好的幼苗相同部位叶片用刀片在叶柄处快速切下，在叶片中脉处接种病原菌菌饼，叶柄用湿润的吸水脱脂棉包裹保湿，每组重复3次，每次处理3片叶；接菌培养1 d后喷洒处理液，空白对照以清水处理；培养6 d后，按式(1)～式(2)计算治疗效果.

(1)

(2)

1.3 数据处理

实验数据采用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析，0.01≤P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著.

2 结果与分析

2.1 一年蓬活性成分的微波提取工艺优化

2.1.1 单因素试验

单因素考察温度、微波功率、料液质量浓度及时间对一年蓬提取液抑菌活性的影响，结果如图1所示.由图1可知，分别在温度60 ℃、微波功率500 W、料液质量浓度1∶60 g/mL、时间6 min时，一年蓬提取液对黄瓜枯萎病菌的抑制率最大.

图1 各因素对一年蓬抑制黄瓜枯萎病菌活性成分提取的影响

2.1.2 响应面试验

由2.1.1可知，温度、料液质量浓度、提取时间对活性成分提取影响较大，微波功率影响较小.因此,以功率500 W为固定提取条件，以时间(A)、料液质量浓度(B)、温度(C)为响应面拟合因素.利用Design-Expert 8.05b软件设计3因素3水平共17 个实验点，并根据公式统计分析得如下二次响应面回归模型：

抑菌率(%)=25.89+0.45A-1.97B-0.52C-1.22AB-1.75AC-1.29BC-4.92A2-6.38B2-4.20C2.

图2 各因素交互作用影响黄瓜枯萎病菌抑制率的曲面图和等高线图

其中A，B，C3个因素之间的交互效应如图2所示.分析图2可知，3个曲面均较陡，3个等高线图均呈椭圆形，说明该响应面各因素间交互效应较强.此外，回归方程模型F检验为显著(P<0.05)，其决定系数R2=0.870 4>0.8，说明该方程模拟真实的三因子水平分析是可行的.利用软件分析得到的最佳提取条件为：时间6.31 min、料液质量浓度1∶59.45 g/mL、温度59.19 ℃.预测在此条件下抑制率为26.02%.结合实际操作中的局限性，确定最后修正的工艺条件为：时间6 min、料液质量浓度1∶60 g/mL、温度60 ℃.在此条件下，进行3组平行实验验证，得其对黄瓜枯萎病菌的抑菌率为(25.89±0.56)%，与预测值相符.

2.2 一年蓬高抑菌活性萃取相的确定

测定一年蓬各萃取相对黄瓜枯萎病菌及番茄早疫病菌的抑制率，结果如表1所示.其中,一年蓬乙酸乙酯相对2种病原菌的抑制率极显著地高于其他萃取相(P<0.01)，因此，确定一年蓬乙酸乙酯相为高活性萃取相.

表1 一年蓬各萃取相对黄瓜枯萎病菌及番茄早疫病菌的抑菌活性

2.3 一年蓬高抑菌活性萃取相的功效验证

2.3.1 平皿抑菌活性测定

不同浓度一年蓬乙酸乙酯相及甲基硫菌灵对2种病原菌的抑制率见表2和表3.由该浓度梯度实验结果可知，一年蓬乙酸乙酯相对黄瓜枯萎病菌的MIC为0.75 mg/mL，对番茄早疫病菌的MIC为1.50 mg/mL，对2种病原菌的MBC皆为36 mg/mL，其中一年蓬乙酸乙酯相对番茄早疫病菌的MBC远小于甲基硫菌灵(112 mg/mL).

表2 一年蓬乙酸乙酯相对黄瓜枯萎病菌和番茄早疫病菌的抑制率

2.3.2 离体叶片抑菌活性测定

一年蓬乙酸乙酯相及甲基硫菌灵对黄瓜枯萎病和番茄早疫病的活体预防效果和治疗效果见表4，实物照片如图3所示.由表4及图3可知，一年蓬乙酸乙酯相对2种病害均具有较好的预防和治疗效果，其中一年蓬乙酸乙酯相对2种病原菌的治疗效果均显著优于甲基硫菌灵(P<0.05).

3 讨 论

本实验以一年蓬为原料，对黄瓜枯萎病菌和番茄早疫病菌的抑制率为指标，经单因素和响应面实验优化得到从一年蓬中提取抑菌活性成分的最佳工艺；一年蓬提取物的乙酸乙酯相对黄瓜枯萎病菌及番茄早疫病菌的抑制率均较高，活体实验(离体叶片法)表明其对2种病害均具有较好的预防和治疗效果.一年蓬为分布广泛的入侵植物，常生于路边旷野或山坡荒地，资源非常丰富，目前利用率很低，一年蓬安全无毒，其嫩茎叶可以作为天然绿色食品食用[18].因此，若以一年蓬提取物的乙酸乙酯相为主要成分进一步开发成植物源杀菌剂，则原料丰富易得、生产成本较低、对环境友好、有助于维持生态平衡；另一方面，如果以此开发出的杀菌剂能在一定范围内取代难降解、易扩散、污染环境的化学杀菌剂，对环境也会起到很好的保护作用，同时可以有效地缓解由化学杀菌剂引发的食品安全问题.研究也为后续实验分离主要功效单体化合物探究抑菌机理，并将其作为先导化合物开发更高效的杀菌剂奠定基础.

表3 甲基硫菌灵对黄瓜枯萎病菌和番茄早疫病菌的抑制率

表4 一年蓬乙酸乙酯相对黄瓜枯萎病及番茄早疫病的活体防治效果

图3 一年蓬乙酸乙酯相对黄瓜枯萎病及番茄早疫病的活体防治效果