施用不同微生物菌剂对新疆灰枣中cAMP含量的影响

张少博，宋 健，禄彩丽，杨文英，张劭恺，李建贵

(1.新疆农业大学林业研究所,新疆 乌鲁木齐 830052；2.新疆红枣工程技术研究中心，新疆 乌鲁木齐 830052)

【研究意义】枣(ZiziphusjujubaMill.)属于“中国五果”之一[1]，是我国第一大干果树种，原产于我国[2-3]，栽培历史悠久，因其含有多种化学成分而具有重要的药用价值，被誉为“木本粮食，滋补佳品”[4-5]。灰枣Zizyphusjujubecv.huizao作为优质的鲜食兼制干品种自引种到新疆，已成为新疆发展红枣产业的主导品种[6]，其质地密、含水量低、含糖量高、风味佳，还含有多种微量元素，以及维生素C和cAMP(环磷酸腺苷，下同)等多种药用成分，具有较高的药用价值和保健作用[7-8]。【前人研究进展】环磷酸腺苷(简称cAMP)，1982年陆汉联分析了多种中草药植物发现，枣中的cAMP含量最高，达100～600 nmol/mL，对不同品种和采收期的枣肉和枣核进行测试发现，枣肉和枣高[10]。在枣cAMP积累规律研究方面，河北农业大学曲泽洲，王永蕙，刘孟军[11-12]，山西果树所赵爱玲等等已有了研究报道[13]。核中的cAMP的含量都随枣果生长而增加，枣肉中的含量较枣核中的少[9]。1991年刘孟军等又借助蛋白结合法对14种园艺植物的cAMP含量进行了测定，发现枣中cAMP的含量最大。【本研究切入点】不同品种果实中cAMP存在差异，而本项目组的前期研究进一步表明，枣果中cAMP含量不仅受到基因(品种)的影响，环境因素对cAMP含量的影响也非常显著，同一品种在不同区域种植的果肉cAMP含量差异可达到一倍[14]，说明通过筛选环境因素，特别是在同一区域内，栽培措施作为影响枣果cAMP含量的主导因子，研究施用微生物菌剂影响灰枣cAMP含量的机制，进而进行人工调控枣果cAMP含量是有意义的。【拟解决的关键问题】本研究在前人研究基础上，以新疆枣主栽品种灰枣为研究对象，开展施用不同微生物菌剂对灰枣中cAMP含量影响的机制研究，为发现影响灰枣中cAMP形成的土壤及施肥因子提供一定的建议与参考，为进一步开展枣果cAMP含量调控研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

库尔勒市位于新疆维吾尔自治区中部，85°14′10″～86°34′21″E、41°10′48″～42°21′36″N。全市行政区域面积 7268 km2，东西长 127 km，南北宽 105 km。库尔勒市位于新疆中部。 库尔勒属暖温带大陆性干旱气候，总日照数 2990 h，无霜期平均 210 d，年平均气温 11.4 ℃，最低为-28 ℃，年平均降水量 58.6 mm，年最大蒸发为 2788.2 mm，主导风向东北风。试验地位于距库尔勒市东北方位约25 km的新疆农业大学林业研究所博湖南山试验基地。试验用灰枣树为嫁接三年生。

1.2 供试菌种

供试菌种包括单一功能株菌株和复合微生物菌剂(表1)。所有菌株均来源于新疆农业大学林业研究所微生物实验室。

1.3 试验方法

1.3.1 实验设计 在试验基地，选取已施9种不同微生物菌剂的灰枣园作为研究对象，施每种微生物菌剂为1个处理，每个处理3个重复，每个重复5棵树，1个空白处理，不施加任何微生物菌剂，2017年4月15日，各处理每棵枣树浇灌菌液原液200 mL，浇灌时需用清水将原液稀释至1000 mL，施入枣树根部(距树干15～30 cm，30 cm深)，清水对照加等量清水，全园统一管理，实验区土壤肥力一致。

在枣果成熟期，采集所对应的的土壤样品以及灰枣枣果样品，带回实验室，进行土壤理化性质分析，以及枣果中cAMP含量的测定，最后对所得数据，运用统计学方法进行分析，从而得到施用微生物菌剂对灰枣园土壤理化性质以及灰枣中cAMP含量的影响。

1.3.2 枣果中cAMP含量的测定方法 (1)流动相配制精确称取 9.526 g 的 KH2PO4，溶解于 700 mL 超纯水中，加入300 mL甲醇，定容至1000 mL容量瓶，过0.22 μm 滤膜，超声波脱气后备用。

(2)标准品溶液配制分别精确称量cAMP标准品5.0 、8.0 、15.0 、30.0 、50.0 mg，超纯水溶解，定容至1000 mL容量瓶。分别取出25 μl 标准品溶液，对其进行UPLC 检测，对上述5种浓度的样本溶液分别进行3次进样，求出平均值。确定色谱条件：色谱柱为pH 2～11，ZORBAX Extend C18 2.1×100 mm 1.8-Micron Rapid Resolution HD 2.1×100 mm 1.8-Micron，流动相为:V(甲醇)∶V(0.1 mol/L磷酸二氢钾)=10∶90；流速0.6 mL/min，温度为室温，进样量20 μl。在不同波长下，测定cAMP标准品溶液的吸收值，确定最佳检测波长256 mm 进行测定。依据上述色谱条件进行研究，得到5.0 ～50.0 mg/L 的浓度范围内，色谱峰面积与样品量为线性关系，c AMP峰面积为纵坐标(Y)，标准液浓度为横坐标(X)，依此计算浓度。

表1 不同处理编号Table 1 The serial number of different treatments

表2 不同处理对土壤养分含量的影响Table 2 Effect of different treatments on soil nutrient contents

(3)样品测定取干燥真空的红枣样本进行研磨粉碎，取出1 g 置于100 mL蒸馏水中，进行 100 ℃水浴加热处理4 h，然后置于3000 r/min 的离心环境下处理5 min，过滤出枣渣，重复进行3次。将3次得到的上清液进行浓缩，得到25 mL 红枣提取样本溶液。对样本溶液进行0.22 μm 滤膜过滤，将所得滤液超声后上高效液相色谱仪进行测定。

1.4 数据处理与分析

数据采用SPSS19.0软件和Microsoft Excel 2007进行处理。

2 结果与分析

2.1 不同微生物菌剂处理下土壤因子基本情况分析

不同微生物菌剂处理下土壤因子之间存在一定的差异(表2)。从变异系数来看，不同微生物菌剂处理下，土壤速效磷差异最为明显，处理9含量最大，空白含量最小；土壤中碱解氮含量差异相对较大，同样处理9含量最大，空白含量最小；其次电导率，电导率最大为处理9，电导率最低为处理1；土壤速效钾和交换性钠含量变异系数较为接近，土壤速效钾含量最高为处理8，最低为空白，交换性钠含量最大为处理5，含量最小为处理2；有机质和pH差异性较小，有机质含量最高为处理1，最低为空白，pH最大为处理1，最低为处理4，pH含量都在8.2左右，呈碱性。

2.2 不同微生物菌剂处理下灰枣果实中cAMP含量分析

由图1可知，不同微生物菌剂处理对灰枣中cAMP含量有不同的影响。相对于空白，无论是单一功能微生物菌剂还是复合微生物菌剂，都会影响灰枣中cAMP含量的提高。就不同微生物菌剂来说，P18(1)处理下灰枣中cAMP含量最高，其次为N22P8P18K7(7)，然后以此为N22(9)、P13(3)、P15P8K7(5)、P13P4K3(6)、P15(2)、K7(8)、P7(4)。

2.3 不同微生物菌剂处理下土壤因子与灰枣果实中cAMP含量相关性分析

在对不同微生物菌剂处理条件下灰枣中cAMP含量和相对应的土壤养分测定的基础上，对不同微生物菌剂处理条件灰枣中cAMP含量和相对应的土壤指标之间做了初步的相关性分析(表3)。

图1 不同处理对cAMP含量的影响Fig.1 Effect of different treatments on cAMP contents

表3 不同处理条件下各土壤指标与灰枣中cAMP含量的相关系数Table 3 The correlation coefficient betweencAMP contents and soil nutrient of gray jujube from different treatments

注：* 在 0.05 水平(双侧)上显著相关。

处理1条件下，灰枣枣果中cAMP含量与土壤中速效磷含量成显著正相关(相关系数r=0.886)，与土壤交换性钠含量、电导率、pH呈显著负相关(相关系数分别为r=-0.986、r=-0.996、r=-0.999)；处理2条件下，灰枣枣果中cAMP含量与土壤中速效磷含量成显著正相关(相关系数r=0.984)，与交换性钠呈显著负相关(相关系数为r=-0.997)；处理3条件下，灰枣枣果中cAMP含量与土壤交换性钠含量、电导率呈显著负相关(相关系数分别为r=-0.882、r=-0.995)；处理4条件下，灰枣枣果中cAMP含量与土壤中碱解氮含量成显著正相关(相关系数r=0.901)，与土壤交换性钠含量、电导率呈显著负相关(相关系数分别为r=-0.972、r=-0.995)；处理5条件下，灰枣枣果中cAMP含量与土壤中碱解氮含量、pH成显著正相关(相关系数r=0.986、r=0.931)，与土壤交换性钠含量呈显著负相关(相关系数r=-0.914)；处理6条件下，灰枣枣果中cAMP含量与土壤电导率呈显著负相关(相关系数分别为r=-0.887)；处理7条件下，灰枣枣果中cAMP含量与土壤pH呈显著负相关(相关系数分别为r=-0.998)；处理8条件下，灰枣枣果中cAMP含量与土壤中碱解氮、速效磷、速效钾含量成显著正相关(相关系数分别为r=0.956、r=0.998、r=0.973)，与土壤有机质含量，电导率呈显著负相关(相关系数分别为r=-0.886、r=-0.956)；处理9条件下，灰枣枣果中cAMP含量与土壤中碱解氮含量、pH成显著正相关(相关系数r=0.997、r=0.919)，与土壤有机质含量呈显著负相关(相关系数分别为r=-0.996)；处理10条件下，灰枣枣果中cAMP含量与土壤中碱解氮、速效磷含量(相关系数分别为r=0.851、r=0.999)，与土壤交换性钠含量呈显著负相关(相关系数分别为r=-0.996)。

2.4 不同土壤类型条件下影响灰枣果实品质的土壤因子的筛选和回归方程建立

不同微生物菌剂处理条件下，土壤养分与果实品质都分属于不同的正态分布总体，根据近代回归分析理论[15]，若某一正态总体中因子间的相关系数R≥0.70，就会存在多重共线问题，容易导致在偏系数很不显著的同时，总回归显著，甚至出现有些系数的符号与实际情况相矛盾，因此还需要用主成分回归、典型相关、岭回归等近代回归方法建立方程。

本研究应用多元逐步回归分析方法，以土壤碱解氮(x1)、速效磷(x2)、速效钾(x3)、有机质(x4)、pH(x5)、电导率(x6)、交换性钠(x7)为一总体；cAMP含量(y1)为一总体，分别筛选出不微生物菌剂处理条件下影响cAMP含量的土壤因子，将筛选出来的因子与cAMP含量建立回归方程，并进行显著性检验，均达到极显著水平，说明建立的方程可靠。筛选出不同微生物菌剂处理条件下影响灰枣中cAMP含量的土壤因子并建立回归方程(表4)。

生态系统中各生态因子之间的关系较为复杂，不同微生物菌剂处理对土壤因子有一定的影响，土壤中不同的生态因子相互影响并综合作用于果实品质的形成，同样对cAMP含量有一定的影响。在进行多元逐步回归分析时，分析按照α=0.10水平，所显示的结果均有显著性意义。10种不同微生物菌剂处理条件下，只有处理1、处理2、处理8、处理9，以及空白处理10条件下，土壤因子与枣果中cAMP含量之间表现出不同的相关性。

表4 不同处理条件下土壤养分与灰枣果实品质多元线性逐步回归分析结果Table 4 Result of the multiple linear regression analysis between fruit quality and soil nutrient of gray jujube from different treatments

处理1条件下，灰枣枣果中cAMP含量与土壤中速效磷含量、pH成显著正相关；处理2条件下，灰枣枣果中cAMP含量与土壤中碱解氮含量、交换性钠成显著正相关；处理8条件下，灰枣枣果中cAMP含量与土壤中碱解氮含量呈显著正相关，与有机质含量成显著负相关；处理9条件下，灰枣枣果中cAMP含量与土壤中碱解氮含量、速效钾含量呈显著正相关；处理10条件下，灰枣枣果中cAMP含量与土壤中交换性钠、pH呈显著正相关。

3 结 论

处理1条件下，灰枣枣果中cAMP含量与土壤中速效磷、土壤交换性钠含量、电导率相关；处理2条件下，灰枣枣果中cAMP含量与土壤中速效磷含量、交换性钠相关；处理3条件下，灰枣枣果中cAMP含量与土壤交换性钠含量、电导率相关；处理4条件下，灰枣枣果中cAMP含量与土壤中碱解氮含量、土壤交换性钠含量、电导率相关；处理5条件下，灰枣枣果中cAMP含量与土壤中碱解氮含量、pH、土壤交换性钠含量相关；处理6条件下，灰枣枣果中cAMP含量与土壤电导率相关；处理7条件下，灰枣枣果中cAMP含量与土壤pH相关；处理8条件下，灰枣枣果中cAMP含量与土壤中碱解氮、速效磷、速效钾、土壤有机质含量，电导率相关；处理9条件下，灰枣枣果中cAMP含量与土壤中碱解氮含量、pH、土壤有机质含量相关；处理10条件下，灰枣枣果中cAMP含量与土壤中碱解氮、速效磷含量、土壤交换性钠含量相关。

通过多元逐步回归分析可知，9种不同微生物菌剂以及空白处理条件下，只有处理1、处理2、处理8、处理9，以及空白处理10条件下，土壤因子与枣果中cAMP含量之间表现出不同的相关性。处理1条件下，灰枣枣果中cAMP含量与土壤中速效磷含量、pH相关；处理2条件下，灰枣枣果中cAMP含量与土壤中碱解氮含量、交换性钠相关；处理8条件下，灰枣枣果中cAMP含量与土壤中碱解氮含量、有机质含量相关；处理9条件下，灰枣枣果中cAMP含量与土壤中碱解氮含量、速效钾含量相关；处理10条件下，灰枣枣果中cAMP含量与土壤中交换性钠、pH呈相关。

4 讨 论

土壤微生物是生态系统中的分解者，它们分解有机质，释放养分，促进植物利用，抑制病毒等[16-17]。微生物菌株的施用，可以改善土壤养分供给和土壤微生物数量等，促使土壤微生物区系修复到健康的状态，促进土壤微生态系统平衡发展[18]，进而对灰枣中cAMP含量产生影响。本试验的结果表明，无论是单一功能微生物菌剂还是复合微生物菌剂，都会影响灰枣中cAMP含量的提高。就不同微生物菌剂而言，P18(1)处理下灰枣中cAMP含量最高，其次为N22P8P18K7(7)，然后以次为N22(9)、P13(3)、P15P8K7(5)、P13P4K3(6)、P15(2)、K7(8)、P7(4)。

综上所述，施用微生物菌剂可以改善土壤土壤环境，促进土壤生态系统平衡健康发展，从而促进植物生长发育[19]。施用微生物菌剂可以有效提高灰枣中cAMP的含量，不同微生物菌剂处理条件下，灰枣中cAMP的含量与土壤养分因子之间表现不一样的相关性，进行多元线性回归分析发现，只有部分微生物菌剂处理条件下，灰枣中cAMP的含量与土壤养分之间表现一定的相关性。本研究仅限于对不同微生物处理条件下对灰枣中cAMP含量以及其与土壤养分之间的关系进行了分析与研究，但是，具体针对不同微生物菌剂如何影响土壤环境，以及如何具体通过使用微生物菌剂对灰枣中cAMP含量进行有效提高，需要进一步的实验与研究。