桥本甲状腺炎对子宫雌激素受体α表达影响

樊 华，李 莉，夏 琴，柳田田，朱德发

桥本甲状腺炎(Hashimoto thyroiditis,HT)又称慢性淋巴性甲状腺炎，是一种好发于女性、以甲状腺大量淋巴细胞浸润及血清甲状腺球蛋白抗体(thyroglobulin antibody,TgAb),甲状腺过氧化物酶抗体(thyroid peroxidase antibody,TPOAb)阳性为特征的自身免疫性疾病[1-2]。近年来关于女性HT患者出现不孕现象的临床报道不断增多。妊娠是一个复杂的过程，而良好的子宫内膜状态为妊娠的前提。子宫内膜状态受到雌激素及其受体的参与调节，雌激素通过与子宫雌激素受体的结合改变子宫内膜形态[3-4]。雌激素受体为核受体超家族中一员，分为ERα、ERβ两种亚型，其中子宫以ERα为主，在女性生殖系统起主要作用[5]。雌激素受体表达异常会影响内膜发育[6]。所以建立实验动物模型，检测动情周期，了解最佳受孕期动情期[7]HT组小鼠子宫内膜ERα水平，同时检测子宫局部细胞因子水平观察HT全身免疫紊乱在子宫局部的表现，为亟待解决的临床桥本氏病致不孕问题提供参考依据。

1 材料与方法

1.1实验动物取30只8～9周龄NOD雌性小鼠，购自北京华阜康生物科技有限公司。安徽医科大学毒理实验室动物标准饲养条件下喂养，体质量20～23 g。

1.2主要仪器及试剂猪甲状腺球蛋白(pig thyroglobulin,pTG)、弗氏完全佐剂(complete freund's adjuvant,CFA)、弗氏不完全佐剂(incomplete freund's adjuvant,IFA)(美国Sigma公司)；三碘甲状腺原氨酸(T3)、甲状腺素(T4)、TgAb及TPOAb试剂盒(德国Roche公司)；促甲状腺激素(thyroid stimulating hormone，TSH)ELISA试剂盒(USCNLIFE公司,CEA463Mu)；兔抗鼠ERα单克隆抗体(美国Abcam公司)；免疫组化化学染色试剂盒、DAB显色试剂盒(北京中杉金桥公司)；细胞因子试剂盒(美国BD公司); 普通PCR仪(杭州晶格科学仪器公司)；低速迷你离心机(海门其林贝尔仪器制备有限公司)；高速台式冷冻离心机(安徽嘉文仪器装备有限公司)；万分之一电子天平(上海菁海仪器有限公司)；荧光定量PCR仪、逆转录试剂盒(美国Thermo Scientific公司)；微板孔迷你离心机(杭州奥盛仪器有限公司)；氯仿、异丙醇、无水乙醇、DEPC-H2O、快速瑞氏染液(南京建成科技有限公司)；苏木精染液(北京索莱宝科技有限公司);荧光显微镜(日本Olympus 公司)；形态学图像分析系统(Image-ProPlus 6.0，美国Media Cybernetics公司)。

1.3动物造模方法30只NOD雌性小鼠适应性喂养1周后，随机分成两组，即CON组和HT组，各15只。造模步骤：将25 μg pTg溶于100 μl PBS溶液中，CFA与pTg溶液1 ∶1混合于研钵中，冰浴条件下研磨至完全乳化。随后将乳状剂抽到一次性注射器中，固定小鼠，在HT组小鼠尾根部1 cm处皮下注射，每只0.1 ml。在CON组注射等量不含pTg的CFA乳化剂。14 d后将CFA替换成IFA，与pTg制备成乳化液，同样操作方法在HT组小鼠尾根部1 cm处皮下注射，每只0.1 ml。在CON组注射等量不含pTg的IFA乳化剂。造模周期49 d。实验经安徽医科大学伦理委员会审核批准。

1.4血清甲状腺素水平测定小鼠经乙醚麻醉后开腹腔，下腔静脉取血1 ml,3 000 r/min离心10 min分离血清，于4 ℃冰箱保存血清。电化学发光免疫分析法检测血清T3、T4、TgAb、TPOAb水平，ELISA法测定血清TSH水平。

1.5阴道脱落细胞染色筛选动情期小鼠阴道分泌物涂片制作步骤：在载玻片上滴一滴生理盐水；取雌性小鼠，于每日上午7～8点检查(连续观察1周),筛选出处于动情期的小鼠。将小鼠背部皮肤握住，尾部朝上，用棉签插入阴道内稍旋转一下，然后抽出；用棉签在载玻片的生理盐水里涂一下，使棉签上的细胞进入生理盐水。瑞氏染色步骤：将玻片平置与染色架上，滴加试剂A 3～5滴，使其迅速盖满玻片，染色约1 min以固定玻片；滴加试剂B 6～10滴，用洗耳球对准玻片吹气充分混合染液，染色5～8 min；蒸馏水冲洗30 s，自然风干，中性树脂封片；镜检。

1.6免疫组化染色检测子宫内膜ERα表达将两组小鼠颈椎脱臼法处死，暴露腹腔，取“Y”字子宫组织，于分叉处剪断，一侧用4%多聚甲醛固定24 h，石蜡包埋，切片。另一侧子宫浸泡于4%多聚甲醛固定。选出阴道脱落细胞染色法确定为动情期的小鼠子宫5 μm石蜡切片,脱蜡，逐级水化，3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶30 min，微波抗原修复，PBS冲洗后血清封闭45 min，一抗37 ℃孵育1 h，4 ℃湿盒过夜(1 ∶1 000)，37 ℃水浴箱复温1 h,PBS冲洗后滴加二抗37 ℃水浴30 min，PBS冲洗后滴加SP 37 ℃水浴30 min。PBS冲洗后DAB显色，苏木精复染25 s，PBS返蓝10 min，逐级脱水后中性树胶封片。显微镜下观察，CON组和HT组均于400倍下随机选取3个视野，形态学图像分析系统分析图片，计算视野内阳性细胞百分比，取平均值。

1.7RT-PCR法检测ERα、白介素(interleukin,IL)-6、IL10mRNA水平提取总RNA:取100 mg组织加入1 ml TRIzol,冰上放置5 min，枪头吹打；每孔裂解液加到EP管中，加0.2 ml氯仿，剧烈震荡15 s，室温放置3 min；4 ℃、12 000 r/min离心15 min，取上清液约500 ml加入另一EP管中；加入0.5 ml异丙醇，温和混匀，室温放置10 min；4 ℃ 12 000 r/min离心10 min，弃去上清液；加入1 ml 75%乙醇(DEPC水配置)，4 ℃ 12 000 r/min离心5 min，弃去上清液；室温放置30 min干燥RNA沉淀；加入20～50 μl DEPC水，55 ℃促溶10 min，-80 ℃保存备用。扩增β-actin：上游引物：5′-AGTGTGACGTTGACATCCGT-3′，下游引物：5′-TGCTAGGAGCCAGAGCAGTA-3′；PCR扩增片段长度为150 bp。扩增ERα上游引物：5′-AGATGACTTGGAAGGCCGAA-3′,下游引物：5′-TGCTAGGAGCCAGAGCAGTA-3′,PCR扩增片段长度为117 bp。扩增IL-6上游引物：5′-AGTCCGGAGAGGAGACTTCA-3′，下游引物：5′-ATTTCCACGATTTCCCAGAG-3′；PCR扩增片段长度为108 bp 。扩增IL-10上游引物：5′-TGCACTACCAAAGCCACAAG-3′，下游引物：5′-TCAGTAAGAGCAGGCAGCAT-3′； PCR扩增片段长度为88 bp。RT反应：在0.2 ml EP管中，加入总RNA(质量为1 μg)、10 μmol/L Oligo(dT)1 μl、DEPC水补足至12 μl，轻轻混匀、点动离心；PCR仪上65 ℃加热5 min，立即冰浴3 min；在上述EP中加入5×Reaction Buffer 4.0 μl、10 mmol/L dNTP Mix 2 μl、RibolockTMRnase inhibitor 1 μl、RevertAidTMM-MuLV Reverse Transcniptase 1 μl；42 ℃、60 min，70 ℃、5 min；取出上述反应液，即为cDNA，-80 ℃保存备用。荧光定量PCR反应：取出cDNA作为荧光定量的模板，反应体系如下：2×SYBR Greenmixture 5 μl；上游引物(10 μmol/L)1μl；下游引物(10 μmol/L)1 μl；cDNA 1 μl；不含RNase的纯水 2 μl。反应条件：95 ℃变性 2 min;95 ℃ 退火5 s;60 ℃延伸10 s,3个步骤进行40个循环。荧光定量结果用 2-ΔΔCt进行分析。

1.8CBA法检测IL-6、IL-10浓度冰上匀浆子宫组织，制备成样本；制备细胞因子标准品；混合细胞因子捕获微球；捕获微球，样本50 μl，检测抗体混合后室温下共孵育2 h；仪器调校微球调节设置流式细胞仪条件；清洗捕获微球/样本/检测抗体复合物；上机检测；运用FCAPv1.0软件进行数据分析。

2 结果

2.1组小鼠血清激素及抗体水平与CON组比较，HT组TgAb、TPOAb显著升高(P<0.05)，两组T3、T4、TSH差异均无统计学意义。见表1。

表1 两组血清甲状腺激素及TgAb、TPOAb水平

与CON组比较：*P<0.05

2.2阴道脱落细胞染色结果CON组和HT组各期在阴道涂片检查的特点：动情前期：全部为有核上皮细胞，偶有少量角化上皮细胞；动情期：大量大而角化的无核细胞，或间有少量有核上皮细胞；动情后期：白细胞，角化上皮细胞，有核上皮细胞均有；动情间期：大量白细胞，少量上皮细胞和黏液。HT组结果见图1。

图1HT组小鼠动情周期阴道上皮细胞变化瑞氏染色×200

A：动情前期；B：动情期；C：动情后期；D：动情间期

2.3两组小鼠免疫组化结果CON组和HT组动情期子宫内膜均有ERα免疫阳性细胞表达。子宫内膜腺上皮、腔上皮及基质均有表达。阳性物质主要存在于胞核，胞质亦有表达。见图2。以平均光密度(average optical density,AOD)值进行量化分析两组子宫内膜阳性反应产物，结果显示CON组子宫内膜ERα水平AOD值(0.220±0.139,n=7)，与HT组 AOD值(0.135±0.082,n=9)差异有统计学意义(t=9.165，P<0.05)。

图2 动情期ERα在子宫内膜分布情况 ×400A： CON组 ; B ：HT组

2.4PCR结果HT组小鼠动情期子宫内膜ERα mRNA水平(1.000±0.208,n=9)低于CON组(0.571±0.082,n=7)(t=5.693，P<0.05)，IL-6和IL-10 mRNA水平均为HT组低于CON组表达(P<0.05)，见表2。

2.5CBA检测两组小鼠子宫细胞上清液IL-6及IL-10浓度结果HT组IL-6水平明显低于CON组(P<0.05)，差异有统计学意义；HT组IL-10水平明显低于CON组(P<0.05)，差异有统计学意义。见表2。

表2 两组子宫IL-6和IL-10 mRNA及蛋白水平

与CON组比较：*P<0.05

3 讨论

HT特征为血清中TgAb、TPOAb升高。本课题利用pTg结合CFA和IFA，经NOD雌性小鼠尾根部皮下注射制成HT实验动物模型[8]，结果示HT组小鼠血清自身抗体TgAb、TPOAb显著升高，提示造模成功。

正常大鼠动情周期包括：动情前期、动情期、动情后期和动情间期。临床多选用阴道脱落细胞染色来鉴别动情周期[7]。本实验通过检测动情周期来观测最佳受孕期动情期，实验显示CON组阴道脱落细胞瑞氏染色结果与以往其他鉴别动情周期实验结果一致[7]，HT组动情周期各期阴道脱落细胞染色结果与CON组小鼠各期结果相似，表明HT小鼠存在动情周期，提示HT小鼠可以受孕。

本实验通过免疫组化法和RT-PCR方法检测怀孕相关受体ERα在动情期子宫内膜上的分布情况和表达水平，了解HT小鼠受孕能力。结果显示HT组小鼠动情期子宫内膜ERα mRNA及蛋白水平均低于CON组。冯雪 等[9]发现在建立的内异症裸鼠的在位子宫内膜上，ERα表达降低。另有研究[10]对黄体功能不足者子宫内膜雌激素受体测定显示含量较正常低。以上疾病均可导致女性受孕率低下甚至不孕。但目前关于HT组小鼠动情期子宫内膜ERα含量低下的原因不清楚。HT是免疫系统疾病，可致全身免疫系统紊乱，选择性检测子宫组织局部IL-6及IL-10两个细胞因子水平，观察子宫局部免疫功能是否紊乱。

RT-PCR检测HT组的子宫IL-6和IL-10 mRNA水平均显著低于CON组，CBA法测出HT组IL-6和IL-10蛋白含量低于CON组。IL-6是一种能参与自身免疫和炎症的多功能细胞因子[11]，在子宫是由内膜腺上皮细胞所分泌[12-13]，主要影响子宫内膜接受囊胚植入的能力。IL-10作为一种多效应的抗炎性细胞因子，可由多种细胞所分泌，能抑制前炎性细胞因子的分泌[14-15]。本实验中出现子宫低水平的IL-6和IL-10，推测可能是HT导致的子宫局部的免疫紊乱，而这种免疫紊乱可能会影响女性HT患者受孕。