基于生存分析模型挖掘HSPB1基因表达与放疗敏感性关系研究

江庆华，王亚民，汤在祥

胃癌是起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤，根据2017年中国癌症统计数据[1]，其发病率和死亡率高居第二位。热休克蛋白(heat shock protein beta-1，HSPB1)是近年发现的重要蛋白，与肿瘤的发生以及放射治疗的预后有密切关系。通过双向凝胶电泳及同位素标记相对和绝对定量技术研究[2]表明，HSBP1基因在前列腺癌组织中呈现高表达，生物信息学分析提示HSPB1在基因表达网络中处于一个非常重要的中心位置。在乳腺癌上，低表达的HSPB1与乳腺癌转移恶化密切关联，低HSPB1表达可能是一个候选肿瘤侵袭性的标志物[3]。在放射敏感性方面，Shen et al[4]研究表明，HSPB1的过表达增强了口腔鳞状上皮癌的放射敏感性，与患者放疗预后显著关联，是放疗的潜在重要生物标志物。在肺癌研究上，HSPB1基因多态性与放射损伤关系密切，meta分析表明，HSPB1基因上rs2868371的基因多态性在高加索人群上与放射损伤关系最为密切，在亚洲人群上并无显著关联[5]。研究[6]表明，热休克蛋白在诸多肿瘤组织中高表达，一般情况下患者生存结局不佳。热休克蛋白通常以受体介导的信号方式影响肿瘤免疫，加速癌症的恶性发展，热休克蛋白与肿瘤干细胞的世代更新、侵染以及转移均存在关系，并且在癌症治疗过程中也起到了负面作用。正常细胞不会分泌热休克蛋白，如果热休克蛋白表达水平高，这反映出细胞或机体的生理环境压力比较大，肿瘤的恶化倾向性比较高，在此条件下放射治疗可能意义不大。反过来，如果热休克蛋白表达水平低，说明细胞或机体的生理环境压力比较小，则此条件下放射治疗的疗效可能会显现出来。然而，有关胃癌放疗敏感性与HSPB1表达的二者之间关系，到目前为止国内外还没有相关研究报道，该研究旨在探讨HSPB1的表达水平与胃癌放疗敏感性的关系，分析其是否有可能成为放疗敏感性的生物标志物。

1 材料与方法

1.1数据来源本研究数据选自TCGA数据库，下载数据后进行数据清理，步骤为：第一步，对临床信息数据，随访信息数据，按患者编号进行合并，然后，去除无生存时间或生存结局的患者，也去除放射治疗信息缺失的患者，获得完整的生存信息和其他临床信息。将此部分临床信息，按患者编号与获得的HSPB1的mRNAseq数据合并，即获得用于最后数据分析的数据，此数据包括完整的生存信息，放射治疗信息，HSPB1的mRNAseq表达数据，以及其他的临床信息，该数据包括371例患者。该分析数据集与本研究团队前期发表的研究[7-8]报道一致。

1.2分析方法本研究定义放疗敏感性为在经过放疗后，与未经过放疗的患者对比，患者的生存率提高，则定义为患者具有放疗敏感性，与此相关的具有敏感性预测能力的基因，称为放疗敏感性预测的生物标志物[7-8]。由于未获得外部独立数据，为了验证本研究的结论，在分析过程中，将数据随机分为两组，一组作为测试组数据，一组作为验证组数据。对两组使用相同的分析方法，如果结论均和本研究假设一致，则验证本研究假设，说明HSPB1的表达与放疗敏感性相关；因HSPB1的表达值呈偏态分布，故将中位数设作高低表达的临界值，分别对高低表达的患者进行统计分析，比较研究两者之间的生存差异[7-8]。

本研究选择的统计软件为R软件，利用其survival包的生存分析模型开展研究工作，选择的生存分析模型为：H(t|X)=h0(t)exp(Xβ)，其中X包括临床指标，以及HSPB1表达水平等信息，以P<0.05作为显著性判断标准，采用rms包进行生存曲线作图。两组生存率比较采用Log Rank检验获得P值，多因素调整中，采用Wald检验计算P值。

1.3统计学处理数据统计处理选择R软件，组间对比采用χ2或Fisher确切概率法，组间总生存的比较采用Log Rank检验，不同临床因素与总生存关系采用单因素和多因素方法进行生存分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1HSBP1表达水平与临床指标和生存期的相关性研究本研究把总生存作为主要观察结局，首先分析HSPB1表达水平及其他临床指标与生存时间关联性分析。对测试组数据和验证组数据的分析结果见表1。由分析结果可见，放疗与患者生存获益紧密关联，在两份数据中，单因素分析和多因素分析均有统计学意义。其他因素，如年龄、N分期，则可能有统计学意义。而HSPB1表达水平无论单因素或多因素分析结果均提示与总生存没有显著关联。在测试组数据和验证数据中，多因素分析P值分别为0.61和0.30。上述分析结果显示，HSPB1表达水平与总生存无明显关联，尽管放疗与总生存率存在关联，但如能筛选出哪些患者具有更好的放疗效应，则可实现更为精准的放疗。

表1 临床指标及HSPB1表达水平与总生存的关系

SRT：印戒细胞癌；DT：弥漫型胃癌；MT：黏液腺癌；PT：乳头状腺癌；TT：管状腺癌；HR：风险比

2.2HSPB1表达水平与临床指标的关系为分析HSPB1与临床指标的相关性，本研究采用χ2分析方法分析了HSPB1的表达与各临床指标的相关性，结果显示，HSPB1的表达无论在测试组数据中还是在验证组数据中均和各临床指标无明显关联。结果表明，如果HSPB1表达水平能够提示放疗敏感性，则可能是个独立于肿瘤临床指标的有效分子标志物。见表2。

表2 HSPB1表达水平与临床指标的关系(n)

2.3高低表达组放疗与生存的关系HSPB1低表达患者的放疗敏感性存在与否是本研究的目的，即HSPB1低表达患者在放疗后，生存率是否提高。分别对测试组数据和验证组数据进行独立统计分析处理。表3结果表明，无论放疗与否，高表达组总生存率并没有明显差异，其他临床因素调整后依然没有明显差异。在低表达组中，研究显示：经过放疗的HR为0.30(0.10～0.85)，其他临床因素调整后HR为0.22(0.06～0.81)，P值分别为0.02和0.02，在验证组数据中，结果与测试组数据的结果一致，即在低表达组中，接受放疗的患者生存率显著提高，多因素调整后的HR为0.03(0.003～0.22)，P值为1.07×10-3。该研究揭示在低表达组这一群体中，经过放疗的患者和未经过放疗的患者，两者之间的生存率差异有统计学意义，经过放疗的患者生存率较高。

图1依次展示了测试组数据和验证组数据中HSPB1高低表达组放疗和非放疗组的生存率曲线。在低表达组(图1B、1D)，接受放疗的患者生存率与未接受放疗的患者生存率差异有统计学意义。而在高表达组(图1A、1C)，两组生存率差异无统计学意义。该结果与本研究假设一致。通常情况下，样本量过小易产生假阳性，为扩大样本容量进行分析，接下来把两组数据合并处理，研究显示，与未经过放疗群体的数据比较，在高表达组群体中，放疗调整后HR为1.03(0.53～1.99)，差异无统计学意义(P=0.94),而在低表达组中，放疗调整后HR为0.10(0.03～0.28)，P值为1.23×10-5。调整因素包括：年龄、性别、TNM分期、靶向治疗等。上述分析结果表明，HSPB1低表达患者可能具有的放疗敏感性，在接受放疗后，其生存率可能会获得改善。合并后的高表达和低表达组放疗和非放疗情况下的生存曲线见图2A、2B，所有放疗患者中HSPB1高表达和低表达患者的生存曲线见图2C。在低表达组中，接受放疗的患者生存率与未接受放疗的患者生存率差异有统计学意义。在所有接受放疗的患者中，HSPB1低表达患者与高表达患者生存率差异具有统计学意义。上述结果提示，HSPB1低表达患者可能具有的放疗敏感性。

3 讨论

在过去的研究中，尽管胃癌放疗并不是主要的治疗手段，但一般认为胃腺癌对放疗比较敏感，一般情况下，经过放疗后，患者生存率将有所提高。本研究依据TCGA数据的研究结果也验证了这一点，即放疗与总生存率两者之间存在明显相关性。但这不等同于经过放疗后全部患者生存率均会有所提高，作为肿瘤治疗的重要手段，放疗产生的毒副作用和远期影响也是不容忽视的，因此精准放疗显得尤为重要。从精准放疗的角度看，倘若将全部胃腺癌患者中不具有放疗敏感性的区分出去，留下具有显著放疗敏感性患者接受放疗，这将使得放疗更加有效和有针对性，同时也使得不敏感的患者避免了放疗带来的不良反应。因此，找到合适的生物标志物分辨敏感人群，实施精准放疗，对于临床治疗具有重要意义[7-8]。然而，截止目前，在胃癌上尚未发现有效的分子标志物。

图1 测试组数据和验证组数据HSPB1表达水平与放疗后生存关系A、B:测试组数据高、低表达患者；C、D:验证组数据高、低表达患者

图2 全部患者HSPB1表达水平与放疗后患者生存关系A：高表达患者；B：低表达患者；C：接受放疗的患者

表3 HSPB1高、低表达组放疗与总生存率关系分析

本研究数据来自TCGA公开数据库的挖掘，对获得的数据开展清理、归类、统计分析等研究工作。考虑到缺乏独立外部数据验证这一实际情况，研究工作采取交叉验证的方法，即将数据随机分成两份，各自进行统计分析[7-8]，结果显示，HSPB1高表达患者群体对放疗不敏感，而低表达患者群体对放疗敏感，经过放疗后，生存期更久，该研究结果对于临床放疗具有一定的指导意义。

临床实践中发现患者放疗后肿瘤退缩程度出现显著差异，这主要是由个体间异质性造成的。基础研究[9-10]表明，放疗的主要靶点是DNA，而放射敏感性主要取决于DNA损伤的修复能力，与DNA修复功能相关的基因突变、多态性等均可使放射敏感性出现差异。HSPB1是热休克蛋白家族中27×103ku的小分子热休克蛋白，在DNA修复方面起着重要的作用，是重要的肿瘤治疗预后指标[10-12]。研究[10，13]表明，如果鼻咽癌细胞中HSPB1表达上升，将提高鼻咽癌细胞对放射线抵抗力。此外，在肺癌中，HSPB1的基因多态性与放疗敏感性关系已有深入研究[14-15]。上述这些研究表明HSPB1基因在放射修复、放疗敏感性方面可能处于重要环节。

关于HSPB1与胃癌放射敏感性研究在国内外尚未见报道，本研究存在样本量较小，且仅仅为TCGA数据等缺陷，尽管本研究采用交叉验证策略，挖掘了HSPB1与胃癌放射敏感性的关系，为胃癌放射敏感性的基础和临床研究提供了线索，但确切的结论仍需要进一步的实验室数据和临床数据的证实。