水飞蓟宾和卡托普利联合用药对大鼠酒精性肝病作用及机制的研究

李光明，李万平，李晓冰，张 红，李 华，李 茂

酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)是由于长期饮酒所致的肝脏疾病，主要有3种类型：酒精性脂肪肝、急性酒精性肝炎和酒精性肝硬化。研究[1]表明，长期大量饮酒，使肝细胞反复发生脂肪变性、坏死和再生，最终引起ALD。其发病机制可能与乙醇及其代谢产物对肝脏的炎症毒性作用、氧应激、免疫介导和细胞因子、细胞凋亡等有关[2]。乙醇在体内氧化及其代谢产物，引起细胞免疫应答，导致细胞和组织的损伤，诱导炎性细胞因子的表达，如肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)[3]，导致肝脏损害，促使核转录因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)的分泌[4]，从而加重了炎症反应，氧化过程产生的活性氧促发氧化应激，加重酒精性肝病[5]。

水飞蓟宾已经成为临床治疗肝病的常用药物之一[6]，是经典的治疗肝损害药物。目前，国内外也很少报道卡托普利用于肝病的治疗，卡托普利与水飞蓟宾宾联合用于酒精性肝病也未见报道。该研究采用食用酒精灌胃SD大鼠并建立酒精型肝病大鼠模型，旨在观察卡托普利和水飞蓟宾联合用药对大鼠酒精性肝病的治疗作用[7]。

1 材料与方法

1.1实验动物健康雄性SD大鼠60只，SPF级,体质量120～150 g , 由西南医科大学动物实验中心提供。

1.2试剂、药品及仪器食用级酒精(纯度为95%，批号：2017022801)购自吉林省新天龙实业股份有限公司，临用时配成所需浓度；卡托普利片(批号：160619)购自国药集团汕头金石制药有限公司；水飞蓟宾胶囊(批号:650709130)购自天津天力士特制药股份公司；大鼠NF-κB酶联免疫反应试剂盒(批号：201705)购自北京安迪华泰生物科技有限公司；大鼠TNF-α酶联免疫反应试剂盒(批号：201705)购自北京安迪华泰生物科技有限公司；西门子ADVIA2400全自动生化分析仪(型号ADVIA2400)购自德国西门子有限公司；电热恒温水槽(型号CU-600)购自上海齐欣科学仪器有限公司；全自动酶标仪(型号ELX808)购自美国伯腾仪器有限公司。

1.3实验方法

1.3.1模型的建立及给药 将健康SD雄性大鼠60只在实验动物房适应地饲养1周，期间自由饮食，饮水。结束后，随机选取12只作为正常组,其余48只大鼠作为造模组，造模组采用35%、40%、45%、50%的酒精每周递增按[1.5 ml/(100 g·d)]分两次灌胃法复制。期间，正常组给予相似的处理，灌胃纯净水。造模6周后，将造模组随机分为4组，每组12只，即模型组、卡托普利组(KT组)、水飞蓟宾组(SF组)、卡托普利和水飞蓟宾联合用药组(KT+SF组)。给药剂量按成人和大鼠体表面积等效剂量折算，持续6周，病理证实脂肪肝形成。第7周开始，造模组在两次灌胃酒精的间隙，模型组灌胃纯净水[1.5 ml/(100 g·d)]，KT[1.35 mg/(100 g·d)]、SF[3.78 mg/(100 g·d)]、KT+SF[1.35 mg/(100 g·d)+3.78 mg/(100 g·d)]，正常组给予相同剂量的纯净水处理，连续灌胃6周。

1.3.2样品的采集与处理 末次灌胃后，禁食不禁水12 h，1%戊巴比妥钠0.4 ml/kg腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，分离血清备用。10%的肝匀浆制备：处于麻醉状态的大鼠，迅速摘取肝脏左叶在预冷的0.9%生理盐水中漂洗数次，滤纸吸干秤全部肝重，再称取0.2 g左右的组织，充分研碎制成10%肝组织匀浆，2 000 r/min 离心10 min，取上清液，-20 ℃冰箱备用。取肝右叶，10%甲醛溶液固定，脱水、石蜡包埋、切片厚度5 mm，苏木精-伊红(HE)染色，放置于200倍光镜下，分析其病理学变化并拍照。实验过程中，有5只大鼠死亡，每组以10只作为样本采集。

1.3.3指标检测方法

1.3.3.1全自动生化分析仪检测 西门子ADVIA2400全自动生化分析仪检测天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)、丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterin，LDL-C)的含量。

1.3.3.2ELISA法 ELISA法检测肝匀浆TNF-α、 NF-κB水平。实验方法按试剂盒说明操作。

1.3.3.3HE染色法 HE染色后观察肝脏组织病理切片。

2 结果

2.1血生化指标

2.1.1ALT 由图1可见，与正常组比较，模型组、卡托普利组、水飞蓟宾组、联合用药组ALT明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，卡托普利组、水飞蓟宾组、联合用药组ALT明显减少，差异有统计学意义 (P<0.05)。

图1 各组大鼠血清ALT含量

1：正常组；2：模型组；3：KT组；4：SF组；5：KT+SF组；与正常组比较：*P<0.05；与模型组比较：#P<0.05，###P<0.001

2.1.2AST 由图2可见，与正常组比较，模型组、卡托普利组、水飞蓟宾组、联合用药组AST明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，卡托普利组、水飞蓟宾组、联合用药组AST明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)。

图2 各组大鼠血清AST含量

1：正常组；2：模型组；3：KT组；4：SF组；5：KT+SF组；与正常组比较:*P<0.05；与模型组比较:#P<0.05，###P<0.001

2.1.3HDL-C 由图3可见，与正常组比较，模型组、卡托普利组、水飞蓟宾组、联合用药组HDL-C明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，卡托普利组、水飞蓟宾组、联合用药组HDL-C明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.1.4LDL-C 由图4可见，与正常组比较，模型组、卡托普利组、水飞蓟宾组、联合用药组LDL-C明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)；与正常组比较，卡托普利组、水飞蓟宾组、联合用药组LDL-C明显减少，差异有统计学意义 (P<0.05)。

2.2NF-κB、TNF-α由图5可见，与正常组比较，模型组、卡托普利组、水飞蓟宾组、联合用药组NF-κB、TNF-α明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，卡托普利组、水飞蓟宾组、联合用药组NF-κB、TNF-α明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)。

图3 各组大鼠血清HDL-C含量

1：正常组；2：模型组；3：KT组；4：SF组；5：KT+SF组；与正常组相比较:*P<0.05；与模型组比较:#P<0.05，###P<0.001

图4 各组大鼠血清LDL-C含量

1：正常组；2：模型组；3：KT组；4：SF组；5：KT+SF组；与正常组比较：*P<0.05；与模型组比较:#P<0.05，###P<0.001

2.3肝脏病理切片光镜下观察：正常组大鼠肝细胞形态正常，肝血窦及门管区清晰，肝小叶呈发散状向四周整齐排列，包浆均匀，未见变性及坏死；模型组大鼠肝细胞肿大，排列散乱，汇管区内有纤维组织增生，伴有炎细胞浸润，大部分肝细胞发生脂肪变，以汽球样肝细胞水样变性为主，有大小不一的脂滴空泡，将细胞核挤压在一边，胞质疏松，呈网状半透明；KT组大鼠肝细胞轻微肿大，排列稍紊乱，脂肪变性及细胞水肿不明显，有少量炎细胞浸润，肝索呈放射状，围绕在中央静脉周围，包浆较为紧密，脂滴空泡数量明显减少，主要为小脂滴；SF组以及KT+SF组与KT组相似。见图6。

3 讨论

少量饮酒对肝脏的损伤，可以自行恢复，如果长期大量高度数饮酒且达到一定极值，有可能会增加肝脏损害风险。为了模拟酒精性肝病模型，本研究采用了目前广泛应用的逐渐增加酒精浓度的灌胃的方法造模。实验结果显示，与正常组比较，模型组血清中ALT、AST、LDL-C，肝匀浆中NF-κB、TNF-α的含量显著升高，血浆中HDL-C的含量显著降低，且模型组肝脏病理切片也呈现出典型肝病症状，说明实验造模成功,为实验的展开提供了证据。研究[8]表明，HDL-C、LDL-C可以衡量胆固醇的运载能力，LDL-C与血清的总胆固醇水平呈正相关性，其主要作用是将肝脏的胆固醇转运到肝外组织细胞。当浓度升高时，易沉积于血管的动脉壁内，形成动脉粥样硬化斑块，阻塞相应的血管。HDL-C与总胆固醇含量呈负相关性，主要作用是将肝外的胆固醇逆向转运，进入肝细胞降解，并进行分解反应，成为胆酸盐。两者的量反应肝脏的功能。实验显示，与模型组比较，联合用药组HDL-C显著增加，LDL-C显著降低，说明联合用药可能通过调节HDL-C、LDL-C的含量，减弱酒精对肝脏的损伤。

图5 各组大鼠肝组织NF-κB 、TNF-α表达

A:NF-κB；B:TNF-α；1：正常组；2：模型组；3：KT组；4：SF组；5：KT+SF组;与正常组比较：*P<0.05；与模型组比较:#P<0.05，###P<0.001

图6 各组大鼠肝脏病理学变化 HE×200

AST和ALT是肝细胞内的重要功能酶，属于肝功能的检测首选指标。AST主要存在于心肌中，其次是肝脏线粒体内。在正常情况下，ALT、AST在血清中含量很低，当肝细胞受损时，肝细胞膜通透性增高，细胞质中的ALT与AST释放进入血浆中，在肝细胞损伤的患者体内，ALT、AST的变化反映疾病进展，检查血清中ALT、AST作为临床诊疗的依据。通过AST与ALT对比显示：用药组的各组大鼠血清中ALT、AST的量比模型组低，且与模型组比较，联合用药组ALT、AST显著降低，推测卡托普利和水飞蓟宾联合用药可能通过调节ALT、AST来保护酒精对肝脏的损伤，其机制可能是对肝细胞膜的功能恢复有改善作用。

在ALD中乙醇破坏了肠道黏膜屏障，同时抑制了Kupffer 细胞的吞噬的功能[9]，Kupffer细胞对内毒素的清除减少，最终导致肠源性内毒素血症。同时，LPS、细胞因子作用于细胞时，可诱发IκB家族成员的顺序磷酸化和泛素化，IκB 降解并从NF-κB上解离下来，暴露NF-κB的核定位信号，使NF-κB通过核孔进入细胞核，并与特定基因的κB位点结合，激活靶基因转录，从而参与细胞分化、发育、凋亡、黏附及炎症反应;加重肝脏细胞的损伤，引起肝脏组织脂肪变性、炎症反应、纤维化，甚至坏死和凋亡。在凋亡方面，在肝炎时，TNF-α的表达导致肝细胞的凋亡。TNF-α的变化是肝脏损伤最早发生的活动之一，在正常情况下，肝脏产生少量TNF-α，但在发生ALD 时，血液中TNF-α水平显著上升。TNF-α通过多种途径诱导细胞凋亡，TNF-α与受体结合，最终导致caspase3活化，使肝细胞凋亡。另一方面，TNF-α能激活NF-κB信号通路，进而增加炎性因子活性，导致炎性因子IL-1等的合成，诱导IL-6合成，进一步加重肝脏炎症反应。本实验显示，各用药组大鼠的TNF-α、NF-κB显著降低，可能是药物减弱了乙醇在体内代谢所引发的炎症反应，减少了酒精对肝脏的损伤。