1株红树林可口革囊星虫共附生放线菌抑制COX-2活性成分的研究

叶子聪，覃翠颖，陈钢，温露

(广东药科大学药学院，广东广州 510006)

COX-2抑制剂(如罗非昔布、尼美舒利等)作为目前临床广泛使用的非甾体抗炎药之一，是通过抑制炎症反应过程中产生的大量COX-2使花生四烯酸转化速度减慢，导致前列腺素的合成减少，从而达到抗炎效果[1-2]。目前，市售的非甾体抗炎药在长期服用后会引起肠胃及肾脏等药物不良反应[3]，因此开发新的COX-2抑制剂对于炎症治疗具有重要意义。

自20世纪60年代起，从海洋微生物中发现结构新颖、生物活性多样的先导化合物已成为研究热点[4]。海洋微生物与海洋动植物存在共附生、寄生等多种相互关系，不仅能从宿主汲取营养物质，还能产生一些生物活性物质来协助宿主防止病原体侵害，与宿主互利共生，是海洋新型生物活性物质的主要生产者[5]。目前，已发现的微生物来源天然产物中约50%来自放线菌[6]。红树林分布于热带和亚热带海岸潮间带，是陆地向海洋过渡带上的特殊生态环境。在适应生态环境与自我保护的同时，通过其特殊的代谢途径产生各种生物活性物质。从红树林微生物中发现具有生物活性的先导化合物也已成为天然产物研究领域的热点[7]。

可口革囊星虫(Phascolosomaesculenta)，俗称泥丁、海丁、土笋等，广泛分布于我国广东、广西和福建等沿海地带，是我国红树林大型无脊椎动物之一。国内外对可口革囊星虫主要在形态学、繁殖发育、虫体和多糖的成分等方面进行研究[8]，但对其共附生微生物的研究未见报道。本文首次对红树林可口革囊星虫共附生放线菌进行分离，通过ISP2液体培养基进行发酵，发酵液经乙酸乙酯萃取得到发酵产物，对发酵产物进行抑制COX-2活性考察，并对其中1株高活性菌株PE05的次级代谢产物进行分离纯化，从中发现具有抗炎活性潜力的物质。

1 仪器与材料

1.1 菌株来源

实验菌株从广东省湛江市国家自然保护区的可口革囊星虫表皮分离得到。活性菌株PE05在改良高氏Ⅰ号培养基上菌落小，起初呈白色，发育一段时间后变黄，呈绒状，参考《伯杰细菌鉴定手册》[9]、《链霉菌鉴定手册》[10]，结合形态特征、培养特征，初步确定该菌为链霉菌属，以改良高氏Ⅰ号斜面保存管于4 ℃条件下保存于广东药科大学药学院。

1.2 仪器与试剂

YM75立式压力蒸汽灭菌锅(上海三申医疗器械有限公司)；TOP-870数控超净工作台(广洁净化设备有限公司)；TCYQ摇床(太仓市实验设备厂)；TDL-5A台式低速大容量离心机(常州市凯航仪器有限公司)；COX抑制剂筛选试剂盒(美国Cayman Chemical公司)；FC酶标仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)；SPX-250C恒温恒湿培养箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；Bruker 400 MHz核磁共振仪(德国Bruker公司)；四级杆飞行时间质谱仪Q-Tof Micro(美国Waters公司)；X-4数字显示显微熔点仪(北京泰克仪器有限公司)。

乙酸乙酯、石油醚、甲醇(广东光华科技股份有限公司)；GF254薄层层析硅胶和200～300目柱层析硅胶(青岛海洋化工厂)；Sephadex LH-20(瑞典Ge Healthcare Bio-Sciences AB公司)。

1.3 培养基

改良髙氏Ⅰ号培养基：可溶性淀粉20.0 g，KNO31.0 g，K2HPO40.5 g，NaCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，琼脂 20.0 g，去离子水1 000 mL，pH 7.2，K2Cr2O7100 μg/mL。

ISP2液体培养基：麦芽提取物10.0 g，葡萄糖4.0 g，酵母浸粉 4.0 g，去离子水1 000 mL，pH 7.2。

2 方法

2.1 共附生放线菌的分离纯化

取新鲜可口革囊星虫样品，用无菌棉棒轻轻擦拭表面泥层，在无菌条件下取其表皮并剪碎，在盛有无菌水的三角瓶中振荡后静置，取上清液。将样品上清液制备成10-1～10-4倍不同稀释度的菌悬液，各取100 μL分别涂布于改良高氏Ⅰ号培养基中，于28 ℃、湿度为80%的恒温恒湿培养箱中培养。待长出菌落后，根据菌落的形态差异，将不同的菌落接种至新的改良高氏Ⅰ号培养基中培养，反复操作直至获得单一菌落。将纯化过后的放线菌接种至改良的高氏Ⅰ号斜面培养基，于4 ℃冰箱中保存。

2.2 共附生放线菌的微量发酵

将11株可口革囊星虫共附生放线菌斜面保存管从冰箱中取出，放至室温，分别将菌株接种于改良高氏Ⅰ号固体培养基上，28 ℃培养3 d后，待长至对数期，接种至ISP2液体培养基(250 mL/三角瓶，共1 L)中，以120 r/min、28 ℃下摇床培养10 d。将发酵液置于55 ℃水浴锅中浓缩。浓缩后3 500 r/min离心20 min，取上清液，上清液用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，减压浓缩，分别得到该菌株发酵液的发酵产物。

2.3 COX-2抑制活性的测定

分别将11株菌的发酵产物浸膏用1%DMSO水溶液配制成质量浓度为20 mg/mL的溶液，按照试剂盒说明书进行实验。并用酶标仪于波长405 nm处测其吸光值(A值)，以测定反应体系中PGF2α的生成量。根据试剂盒的计算公式，抑制率=(全活性组的平均PG值-给药组的平均PG值)/(全活性组的平均PG值-背景组的平均PG值)×100%，得到样品对COX-2 抑制活性百分率(%)。

2.4 活性菌株的发酵

选用ISP2液体培养基对活性菌株PE05进行大量发酵：在无菌条件下，将菌株PE05接至改良高氏Ⅰ号培养基上进行活化，于28 ℃培养3 d，然后接种至10个含有250 mL ISP2液体培养基的三角瓶中，28 ℃、120 r/min摇床培养2 d至长出菌丝体作为大量发酵的种子培养液。配制ISP2培养基100 L，分装于400个500 mL三角瓶中，每瓶250 mL，高压灭菌。每瓶接入1 mL种子液，摇床培养10 d。

2.5 代谢产物的提取与分离纯化

将100 L发酵液置于55 ℃水浴锅中浓缩至10 L，将浓缩液以3 500 r/min离心20 min，得到上清液。用等体积的乙酸乙酯萃取至有机层无色，减压浓缩得发酵液粗提物浸膏30.0 g。

浸膏经硅胶柱层析分离，以石油醚-乙酸乙酯(体积比分别为90∶10、70∶30、50∶50、30∶70和0∶100)、乙酸乙酯-甲醇(体积比分别为100∶1、50∶50、0∶100)进行梯度洗脱，得到25个组分Fr1-25。Fr5经硅胶柱层析(石油醚-乙酸乙酯，体积比80∶20)进一步纯化，得到2个组分(Fr5-1和Fr5-2)。Fr5-1经Sephadex LH-20(三氯甲烷-甲醇，体积比50∶50)进一步纯化得到化合物3(8 mg)。Fr11经硅胶柱层析(石油醚-乙酸乙酯，体积比90∶10)进一步纯化，得到Fr11-1经Sephadex LH-20(三氯甲烷-甲醇，体积比50∶50)进一步纯化得到化合物1(3 mg)。Fr12经硅胶柱层析(石油醚-乙酸乙酯，体积比70∶30)进一步纯化，得到4个组分(Fr12-1～Fr12-4)。Fr12-1经甲醇重结晶得到化合物4(10 mg)。Fr12-4经Sephadex LH-20(甲醇)进一步纯化得到化合物2(3 mg)。Fr15经硅胶柱层析(石油醚-乙酸乙酯，体积比55∶45)进一步纯化，得到3个组分(Fr15-1～Fr15-3)。Fr15-1经Sephadex LH-20(甲醇)进一步纯化得到化合物5(8 mg)。

3 结果

3.1 COX-2抑制活性筛选结果

通过COX抑制活性试剂盒对分离所得11株共附生放线菌，经ISP2液体培养基发酵、乙酸乙酯提取后得到发酵产物，对各发酵产物进行COX-2抑制活性筛选，结果显示有6株菌的发酵产物对COX-2具有一定的抑制活性，占所分离菌株总数的54.5%(见表1)，其中PE05发酵产物的抑制率高达92.75%。

表1 红树林可口革囊星虫共附生放线菌发酵产物的COX-2抑制作用

Table1COX-2 inhibitory activities of the fermentation products from symbiotic actinomycetes.

菌株编号COX-2抑制率/%菌株编号COX-2抑制率/%PE0255.43PE0673.02PE0484.24PE0983.11PE0592.75PE1075.78

3.2 结构鉴定

化合物1：黄色固体，易溶于丙酮，mp 207～209 ℃。ESI-MS(m/z)：167[M-H]-，分子式为C8H8O4。1H NMR(400 MHz,Acetone-d6)δ：3.90(3H，s，4-OCH3)，6.90(1H，d，J=8.0 Hz，H-5)，7.55(1H，d，J=2.0 Hz，H-2)，7.58(1H，dd，J=2.0，8.0 Hz，H-6)。13C NMR(100 MHz,Acetone-d6)δ：122.0(C-1)，114.6(C-2)，147.2(C-3)，151.1(C-4)，112.6(C-5)，123.9(C-6)，166.6(C-7)，55.4(4-OCH3)。以上数据与文献[11]报道一致，故鉴定化合物1为香草酸(vanillic acid)。

化合物2：白色固体，易溶于丙酮，mp 210～212 ℃。ESI-MS(m/z)：137.1[M-H]-，分子式为C7H6O3。1H NMR(400 MHz,Acetone-d6)δ：7.92(1H，d，J=8.0 Hz，H-3′，5′)，6.92(1H，d，J=8.0 Hz，H-2′，6′)。13C NMR(100 MHz,Acetone-d6)δ：167.5(—COOH)，122.7(C-1′)，162.6(C-4′)，132.7(C-3′，C-5′)，116.0(C-2′，C-6′)。以上数据与文献[12]报道一致，故鉴定化合物2为对羟基苯甲酸(4-hydroxybenzoie acid)。

化合物3：白色晶体，易溶于三氯甲烷，mp 76～78 ℃。ESI-MS(m/z)：135.0[M-H]-，分子式为C8H8O2。1H-NMR(400 MHz,CDCl3)δ：10.70(1H，s，COOH)，7.32-7.41(5H，m，H-2′，3′，4′，5′，6′)，3.70(2H，s，H-2)。13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ：178.3(—COOH)，133.4(C-1′)，129.5(C-2′，6′)，128.8(C-3′，5′)，127.5(C-4′)，41.2(C-2)。以上数据与文献[13]报道一致，故鉴定化合物3为苯乙酸(phenylethyl acid)。

化合物4：白色固体，易溶于甲醇，mp 235～237 ℃。ESI-MS(m/z)：124.0[M+H]+，分子式为C6H5NO2。1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ：13.39(1H，s，—COOH)，9.07(1H，d，J=2.2 Hz，H-2)，8.79(1H，dd，J=2.0，4.8 Hz，H-6)，8.26(1H，dt，J=4.0，8.0 Hz，H-4)，7.54(1H ，ddd，J=4.0，8.0，12.0 Hz，H-5)。13C NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ：166.2(—COOH)，153.3(C-2)，126.6(C-3)，136.9(C-4)，123.8(C-5)，150.2(C-6)。以上数据与文献[14]报道一致，故鉴定化合物4为烟酸(nicotinic acid)。

化合物5：白色晶体，易溶于三氯甲烷，mp 154～156 ℃。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ：6.40(1H，s，NH)，4.11(1H，t，J=8.0 Hz，H-6)，4.00(1H，dd，J=4.0，8.0 Hz，H-9)，3.56(2H，m，H-3a，3b)，2.34(1H，m，H-5a)，2.12(1H，m，H-5b)，2.01(2H，m，H-4a，10a)，1.89(1H，m，H-4b)，1.77(1H，m，H-11)，1.52(1H，m，H-10b)，0.99(3H，d，J=4.0 Hz，H-12)，0.94(3H，d，J=4.0 Hz，H-13)。13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ：170.7(C-1)，166.4(C-7)，59.1(C-6)，53.6(C-9)，45.6(C-3)，38.7(C-10)，28.2(C-5)，24.8(C-11)，23.4(C-12)，22.9(C-4)，21.4(C-13)。以上数据与文献[15]报道一致，故鉴定化合物5为环(脯-亮)二肽[cyclo-(Pro-Leu)]。

4 结论

本文首次从广东湛江红树林可口革囊星虫表皮中分离得到11株共附生放线菌，并对其发酵产物进行抑制COX-2活性的考察，结果表明有6株菌的发酵产物对COX-2具有不同程度的抑制作用，其中PE05的抑制率达到92.75%。为进一步确定菌株PE05的抑制COX-2活性成分，对该菌株的发酵产物进行分离纯化得到5个化合物，经结构鉴定确定为香草酸、对羟基苯甲酸、苯乙酸、烟酸、环(脯-亮)二肽。目前，已有研究表明香草酸具有一定的抗炎活性[16]，其余4个化合物尚未有文献报道过其抗炎活性，今后将进一步探究4个化合物的抑制COX-2活性，为发现新型COX-2抑制剂奠定基础。